|
一、内参介绍 内参是western blot法非常重要而必须的部分。它保证了目的蛋白表达量的相对多少。内参是指由细胞中管家基因编码的蛋白，其在各组织细胞中的表达相对稳定，因此在测定目的蛋白的相对水平时常用它做对照物。 哺乳动物细胞中常用的内参很多且分布广泛：全细胞或细胞浆中---tubulin (微管蛋白), actin (肌动蛋白), GAPDH,等；细胞核中----Lamin B1, HDAC, PCNA, Histone H3等；线粒体中----HSP60, COX IV等。 全细胞或胞浆蛋白 （1）肌动蛋白： 肌动蛋白是高度保守的，在脊椎动物中是由六种蛋白组成：α-actin, α1 -actin, β-actin, γ1-actin 和γ2-actin。β-actin和γ1-actin是两种非肌型肌动蛋白。它们充当微丝的主要组成部分。来源于各种如人、小鼠和鸡的β-actin都是相同的。人源β-actin与真菌的同源蛋白有近90%的相同性。人源β-actin与人源肌动蛋白家族中的其它成员至少有93%是相同的。这些肌动蛋白家族成员间以及种族间的同源性信息对于抗体选择和解释蛋白质印迹条带是很重要的。 α-actin和β-actin在western blot中一直被用作内参。肌动蛋白在细胞中浓度很高，因此为了检测到肌动蛋白量的任何变化，调整上样体积和蛋白质印迹操作流程是很重要的。 细胞生长条件的改变会破坏肌动蛋白的合成。有报道表明beta肌动蛋白在蛋白质印迹分析中可能不是一个可靠的内参。beta肌动蛋白也存在于核内，作为染色质重塑复合物的一个组成部分，但不能用于核蛋白样品的对照。 （2）GAPDH GAPDH的全称是甘油醛-3-磷酸脱氢酶。GAPDH是一个管家基因，在western blot和PCR中都被用作参照。 GAPDH在物种间是高度保守的。例如，人源由335个氨基酸组成的GAPDH其全长有70%与Arabidopsis thaliana中由422个氨基酸组成的同源蛋白是相同的。 它存在于胞浆、细胞核、核周区及膜上。 一项全面的研究表明GAPDH mRNA水平在不同组织类型中有显著差异，但是相对于年龄和性别而言却是保持恒定的。缺氧可上调GAPDH的表达，导致GAPDH聚集。因此不能在涉及氧气的相关研究中作为内参。有趣的是，它是用于治疗牛皮癣和多发性硬化症的免疫调节药物的靶点，比如富马酸二甲酯，它可以琥珀酸化和灭活GAPDH的催化半胱氨酸。 （3）tubulin Tubulin即微管蛋白，分为5种：α, β, γ, δ和ε。α和β微管蛋白组成的异源二聚体是微管的构成组分。 α微管蛋白的亚型包括1a (TUBA1A)、1b (TUBA1B)、1c (TUBA1C)、3c (TUBA3C)、3d (TUBA3D)、3e (TUBA3E)、4a (TUBA4A)和8 (TUBA8)。I类(TUBB)、IIa类(TUBB2A)、IIb类(TUBB2B)、III类(TUBB3)、IVa类(TUBB4A)、IVb类(TUBB4B)、V类(TUBB6)、VI类(TUBB1)和VIII类(TUBB8)都是β微管蛋白的亚型。 γ微管蛋白，γ1(TUBG1)和2(TUBG2)，参与微管的成核和极性排列，并存在于中心体和纺锤体极体中。δ (TUBD1)和ε (TUBE1)微管蛋白往往位于中心粒处，并且是有丝分裂纺锤体的结构部件。微管蛋白在物种间是高度保守的。例如，人源有451个氨基酸的微管蛋白α1a与酵母中由445个氨基酸组成的同源蛋白Tub3p有74%是相同的。α、β, γ的亚型也都是非常类似的。人源α微管蛋白相互间有超过90%的相同性。不同型的微管蛋白也有显著的同源性。人源α微管蛋白和人源β微管蛋白有40%相同性。α, β, γ微管蛋白都一直被用作内参。微管蛋白是多个药物的作用靶点，如抗癌药物紫杉醇（Taxol）、多西紫杉醇、长春碱（vinblastine）和 长春新碱（vincristine），抗痛风剂秋水仙碱（colchicine）和抗真菌药物灰黄霉素（griseofulvin）。这些药物都会影响体外和体内的微管蛋白表达。因此有这些药物作用时内参勿选tubulin。
核蛋白 (1) Lamin B1 核纤层蛋白是核纤层的结构部件，用于支撑核被膜并参与细胞周期中核被膜的解体和再形成。在动物细胞中，3种基因编码了至少7种核纤层蛋白。LMNA基因通过可变剪接编码A型和C型核纤层蛋白，而LMNB1和LMNB2分别编码核纤层蛋白B1和B2。B型核纤层蛋白存在于每个细胞。A型核纤层蛋白在原肠胚形成后表达，C型核纤层蛋白的表达是组织特异性的。核纤层蛋白会进行法尼基化和磷酸化等翻译后修饰，从而调节核纤层的组装和核纤层蛋白的活性。在核纤层蛋白中，核纤层蛋白B1往往被用作内参。核纤层蛋白B1在物种间是高度保守的。人源核纤层蛋白B1与啮齿目动物中的同源蛋白有95%的相同性，与果蝇的同源蛋白有36%的相同性。人源核纤层蛋白B1与其它人源核纤层蛋白有50%以上的相同性。 核纤层蛋白B1对于没有核被膜的样品是不适合作为内参的。 (2) TBP TATA结合蛋白，TBP，是在由RNA聚合酶II进行基因转录前能特异性结合到TATA框DNA序列的通用转录因子。TATA框存在于10-20%的人类启动子中。TBP的N端有一长串谷氨酰胺（TBP mRNA中的CAG重复），可以调节C端的DNA结合活性。正常人群中TBP N端的谷氨酰胺数量是不尽相同的（25至42个重复），并且在某些病理状态下会延长至47-63个重复。TBP是高度保守的。人源TBP与啮齿目动物中的同源蛋白有90%的相同性，与真菌的同源蛋白有超过60-70%的相同性。 (3) PCNA 增殖细胞核抗原，PCNA，是DNA聚合酶delta的一个辅助因子，并且在细胞周期的DNA合成阶段（S期）在细胞核内表达。PCNA参与真核DNA复制。PCNA在黑猩猩、狗、牛、大鼠、鸡、斑马鱼、果蝇、蚊子、裂殖酵母、芽殖酵母、克鲁维酵母（K. lactis）、棉阿舒囊霉（E. gossypii）、稻瘟病菌（M. grisea）、粗糙脉孢菌（N. crassa）、拟南芥和水稻中都是保守的。人源由261个氨基酸组成的PCNA与啮齿目动物中的同源蛋白有97%的相同性，与酵母中的同源蛋白有36%的相同性。PCNA对于非增殖细胞或经过抗增殖处理的细胞并不是一个好的内参。
线粒体蛋白 (1) VDCA1/孔蛋白（porin） 电压依赖性阴离子通道，作为一类孔蛋白家族，构成了真核细胞中线粒体外膜上的主要蛋白。在脊椎动物中至少有三种成员（VDAC1、VDAC2和VDAC3）。VDAC1在线粒体外膜和质膜上都有，发挥着不同的功能。它表达于心脏、肝和肌肉组织中。由于可变剪接导致了有多种变体。VDAC1基因在黑猩猩、狗、牛、小鼠、大鼠、鸡和斑马鱼中是保守的。人源VDAC1与小鼠的同源蛋白有99%的相同性，与斑马鱼的同源蛋白有85%的相同性。相关例子见 [20] 。 (2) COX4I1 位于线粒体内膜的细胞色素C氧化酶是线粒体电子传递链中的最后一个酶复合体。该复合体由13个线粒体编码和核编码的亚基组成。 细胞色素C氧化酶的亚基IV通常被用作内参。它有两种亚型（亚型1和2）。它们由两个核基因编码（COX4I1和COX4I2）。亚型1是广泛表达的，亚型2是高度表达于肺部组织的。这两种亚型在人当中有60%的相同性。亚型I COX4I1被用作内参。人源COX4I1与小鼠的同源蛋白有80%的相同性，与斑马鱼的同源蛋白有63%是相同的。 （部分内容转引自： http://www./method/Loading-Controls-for-Western-Blots.html）
二、内参选择 由于很多抗体公司的内参抗体是用抗原片段制备的，不同的公司选择的片段不一样。因此，要选择对应的内参就要遵循相应的原则： （1）目的蛋白表达部位 胞浆和全细胞蛋白：β-actin（43KD）、GAPDH（37KD）、Tubulin（55KD）等； 胞核蛋白：PCNA（29KD）、Histone H3（17KD）等； 核膜蛋白：Lamin B（66KD）等； 胞膜蛋白：Na+/K+-ATPase（120KD）等； 线粒体蛋白：COX IV（17KD）、VDAC1（30KD）等。 （2）实验环境 有些细胞在某些条件下内参表达会出现异常，使其不适合做内参。比如某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高，不适合做内参。在凋亡实验时，Lamin等也不适合作为内参。在加入抗癌和抗真菌药物时，Tubulin的表达易受影响，不适合作为内参。Lamin B不适合作为胚胎干细胞的内参，而PCNA不适合作为非增殖细胞的内参等。因此设计实验方案的时候应该考虑这些因素并查询相应文献，在实验过程中也应该注意如果内参表达出现异常，应考虑这方面因素。 （3）不同的组织特异性 actin 即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。actin 大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin，其余两种广泛分布于各种组织中，包括beta-actin（β-non-muscle）和gamma-non-muscle actin。这些不同的亚型组织分布是不一样的，在肌肉组织中beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的组织本来就应该选择不同的内参，不能一概而论。
三、怎样才能跑出完美的内参条带? 我们在western blot实验中可能会遇到内参条带不齐的情况，那么是什么原因造成的呢？ 现在我就自己7年多的转印经验给出可能的原因： （1）蛋白收集及定量： 首先，自己的蛋白定量是否精准？线性回归几个9？（至少要2个）其次，收集蛋白上清时，切记切记：tips不能触碰到沉淀或吸取少许沉淀！！！因为哪怕是一点点沉淀都会导致该样品的蛋白浓度不均，严重影响蛋白定量的精准性。 （2）上样时要保证各组蛋白浓度一致，同体积或同质量。同时，小心上样，避免蛋白丢失，即有些蛋白加到槽外。 （3）转膜时（湿法或半干转法），特别是半干转法，务必保证上下层滤纸充分浸泡在转膜液中，使之达到饱和！滤纸放到转膜仪上要设法保证滤纸的平整。滤纸与滤纸之间，滤纸与PVDF膜之间尽可能的驱赶气泡！ （4）抗体：一抗用过3次往后就不要用了，直接换新的。内参不齐，其实抗体量不多了或孵育时抗体与目的条带分布不均也是一个主要原因。记住：遇到这种情况：换新抗体，孵育时抗体及条带充分接触且延长孵育时间！ （5）药物或其他外界因素：上文提到过，使用影响围观蛋白的药物作用细胞，如长春新碱、紫杉醇等不要用tubulin蛋白；在做缺氧相关实验时不要用GAPDH；有些药物导致细胞生长发生改变时尽量避免使用actin。其实，当你没注意这些条件时，发现内参不齐，可以再跑下其他的内参条带做进一步验证。 （6）蛋白上样时，样品要混匀，特别是做CO-IP实验蛋白样品中含珠子的一定要充分混匀，别怕麻烦！ （7）分离好蛋白上清，在加Loading buffer，ddH2O前药先把金属浴仪器打开，使其尽快达到预定温度。然后快速于每个蛋白样品中加入LB和水。这样可防止蛋白的继续降解！！ 希望对大家有所帮助！！ |
|
|
