临床上最常用的基因检测技术

 肿瘤基因检测是指应用分子生物学技术，从基因水平检测细胞和组织的肿瘤分子靶标变化，以协助病理诊断和分型、指导靶向治疗、预测治疗反应及判断预后的一种病理诊断技术，也称为肿瘤分子病理。目前，临床上最常用的检测技术平台有：荧光PCR技术、ARMS-PCR技术、Sanger测序技术、高通量测序技术（NGS）、FISH技术等。

◎荧光PCR技术

荧光定量PCR（realtime-PCR）技术是几年基于普通PCR技术发展的一种新技术。它借助荧光信号来检测PCR产物，通过荧光染料或荧光标记的特异探针，对PCR产物进行标记跟踪，在扩增过程中，每经过一次循环，荧光定量PCR法检测目的基因仅需检测样本是否具有扩增信号即可，且PCR反应具有核酸扩增的高效性，可检测出微小突变。根据探针标记不同可分为TaqMan探针法和ARMS法，ARMS法的灵敏度比TaqMan探针法更高，更容易从大量野生型DNA中选择富集低浓度的DNA突变。

◎ARMS-PCR技术

扩增阻碍突变系统（ARMS）是PCR技术应用的发展，也称等位基因特性PCR（AS-PCR）等，用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计两个5'端引物，一个与正常 DNA互补, 一个与突变 DNA互补, 对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3'端引物进行两个平行 PCR, 只有与突变 DNA完全互补的引物才可延伸并得到PCR 扩増产物。如果错配位于引物的3'端则导致PCR不能延伸。

ARMS-PCR是目前实验室常用的基因突变检测方法。ARMS-PCR法检测灵敏度高，可检测肿瘤细胞中突变比例为 l %甚至更低的突变基因 。

◎ Sanger测序技术

Sanger测序法的基本原理是在 DNA聚合酶的作用下, 将 dNTP/ddNTP的混合物加到特异性引物的末端, 产生长短不等的寡核苷酸链 , 并带有与四种碱基对应荧光标记。 当带有荧光标记的寡核苷酸链混合物通过基因分析仪毛细管进行电泳分离时, 软件就能根据荧光颜色判断对应碱基, 而根据荧光信号出現的先后顺序, 判断对应碱基在序列中所处的位置, 以此获得特定基因特定位点及片段的 DNA序列, 从而达到鉴别诊断疾病的分子发病机制、 指导临床疾病治疗的目标。

Sanger序列分析是分子病理高端核心的“金标准”技术,被广泛用于传染病、遗传病、性病、血液病、神经系统疾病、肿癌等众多临床顽疾的分子生物学诊断、 鉴别诊断及治疗领域,尤其在肿瘤的分子病理诊断、鉴别诊断、肿瘤基因突变分析、肿癌分子分期分型、肿瘤靶向治疗辅助诊断、肿瘤化学治疗疗效预测等肿瘤分子病理领域,具有直观、全面、尖端、可靠的突出优势。

◎高通量测序技术(NGS)

NGS又称大规模平行测序(MPS),包含多种可以一次性产生大量数字化基因序列的测序技术, 是继 Sanger测序的革命性进步, 采用平行测序的理念, 能够同时对上百万甚至数十亿个 DNA分子进行测序, 实现了大规模、 高通量测序的目标。不同厂家的产品测序原理不同,主要分为边合成边测序(SBS)、基于“DNA簇”和可逆性末端终结大规模平行测序、4色荧光标记寡核苷酸的连续连接反应测序和半导体芯片测序。

高通量测序技术不仪可以进行大规模基因组测序, 还可用于基因表达分析、非编码小分子RNA的鉴定、 转录因子靶基因的筛选和 DNA甲基化等相关研究。

高通量测序技术有三大优点是传统Sanger测序法所不具备的。第一, 它利用芯片进行测序,可以在数百万个点上同时阅读测序。第二,高通量测序技术有定量功能, 样品中 DNA被测序的次数反映了样品中这种 DNA的丰度。 第三、 利用传统 Sanger测序法完成的人类基因组计划总计耗资27亿美元, 而現在利用高通量测序技术进行人类基因组测序, 测序成本只需一千美金。

◎荧光原位杂交技术

荧光原位杂交(FISH)技术基本原理与显色原位杂交相同,不同之处在于FISH是应用荧光素标记的探针与组织细胞中待测核酸反应形成杂交体, 并采用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察信号表达。 为了同时检测多个靶位, 在荧光原位杂交技术的基础上发展起来一种新技术, 即多彩色荧光原位杂交。 它用几种不同颜色的荧光素单独或者混合标记的探针进行原位杂交, 能同时检测多个基因, 扩大了 FISH技术的临床应用 。

FISH技术日前主要应用于染色体和 DNA水平上的病理诊断检测。 染色体FISH主要检测染色体易位、缺失、重复、变异等; DNA FISH主要是检测基因突变、扩増、易位、缺失、重复、变异等。与原位杂交技术相比,FISH更加安全、快速、特异性好、定位准确。