三代 二代----全长转录组研究思路解析

第三代测序技术Pacbio利用单分子实时测序(SMRT, single molecular real time sequencing)技术，无需组装即可直接获取5’端到3’端完整的全长转录本，具有超长的读长，因此可得到更高质量的转录本，有利于mRNA结构的研究，如可变剪切、融合基因、等位基因表达等。

全长转录组的研究越来越热门，联合二代转录组测序更是成为热门中的热门，基迪奥生物除了提供标准的三代全长转录组和二代转录组测序分析外，还可以利用二代转录组测序数据校正三代全长转录组数据，提高三代数据利用率；同时利用三代全长转录组数据优化二代参考基因组，提高二代定量结果的准确性。小编通过综合三代经典文献思路和已有的项目经验，总结了较全面的三代研究设计方案，供大家参考。

三代测序

利用三代测序，得到某物种的全长转录本集合，研究转录本结构时，比基于参考基因组预测到的转录组信息更准确，可准确鉴定基因的可变剪接、融合基因、基因家族和lncRNA等信息。

A.单个组织取样：研究特定组织的全长转录组；

B.多个组织进行混样：等量RNA混合测序，获得物种完整的全长转录组；

C.多个组织分别取样：比较不同组织或不同处理的全长转录组；

案例（微信文章链接）：

全长转录组应用系列一：可变polyA检测

Iso-Seq应用系列(二):可变剪切分析

全长转录组应用系列(三):融合基因检测

 

三代+二代测序

二代数据可以进行基因差异表达分析，也可以对三代数据的结果进行校正；同时三代数据可以辅助参考基因组优化，使定量结果更准确。

A.利用二代数据对三代数据的结果进行校正，以三代数据结果为重点，分析讨论基因结构相关研究[1]；

微信文章链接：三代全长转录组的研究思路（毛竹全长转录组）

 

B.三代数据分析基因结构，同时还可以深入研究某基因可变剪接形成的不同转录本的表达差异，分析转录组动态变化；

全长转录组发现新的前列腺癌生物标志物[2]

发表期刊：ClinicalCancer Research；影响因子：13.214（2017）

雄性激素受体（Androgenreceptor，AR）是正常前列腺细胞和前列腺癌细胞中最主要的转录调节因子，前列腺癌患者中表达多个AR变异体（AR-V），其中AR-v7可以提高前列腺癌对AR靶向治疗的抗性。但由于受二代测序读长的限制，无法对完整的AR及AR-V进行准确定量；并且尚不清楚是否有其它AR-V与AR-V7共同表达，影响对AR靶向治疗的抗性。结合二代和三代测序，对去势抵抗性前列腺癌（CPRC）中AR及AR-V的基因结构和表达丰度重新注释。

 

C.联合比较转录组研究物种进化，通过分析直系同源基因，研究近源物种间的亲缘关系，挖掘关键基因与分子机制[3]。

 

三代全长+二代测序+蛋白

通过三代鉴定得到isoforms，增加新的转录本信息；二代分析可用于对转录本定量及差异分析；蛋白质组证明哪个可变剪接形成的转录本被翻译成了蛋白质，及不同可变剪接形式所产生的蛋白丰度变化。

联合蛋白组研究脱落酸处理拟南芥的转录和翻译分子机制[4]

发表期刊：The Plant Journal；影响因子：5.775（2017）

在真核生物中，可变剪切机制有助于蛋白的多样性，在应激反应和发育过程中起着至关重要的作用，然而其机制在植物中少见报导。由于脱落酸ABA是一种重要的植物激素，参与了各种胁迫反应，ABA信号转导中的转录调控受到了广泛研究，而转录后调控研究的较少。通过选择6h和48h的对照组和ABA处理样本进行二代测序和蛋白质组检测，6h的对照组和处理组进行三代测序，联合二代测序、三代全长转录组测序和蛋白质组，研究在ABA处理下，拟南芥的转录和翻译机制。

三代全长+二代测序（+miRNA/lncRNA）+甲基化

联合甲基化数据和三代数据获得可变剪切位点信息，分析甲基化与可变剪切位点的关系；同时利用二代数据，准确分析可变剪接关键转录本表达水平变化； miRNA/lncRNA进一步丰富研究内容，如研究miRNA调控转录本的可变剪切。

全长转录组+小RNA+甲基化联合研究异源多倍体棉花[5]

期刊： New Phytologist；影响因子：7.433（2018）

棉花是纺织业重要的天然可再生能源，也是异源多倍体研究的理想模型。本研究采集不同植株根、胚轴、叶、花瓣、花粉、柱头组织，即非纤维组织样品；开花7、10、12、20、30天后（DAP）的棉花纤维组织。混合不同植株样品，等量RNA混合为纤维和非纤维两种，进行三代和小RNA测序，以及利用0、10、20、30DAP棉花纤维DNA甲基化测序数据，首次系统探究异源四倍体棉花全长转录组的AS特征，并从小RNA和DNA甲基化等角度揭示AS的调控机制。

 

今天的内容就介绍到这里啦，祝您生活愉快，今天比昨天更博学~

 

Tips:

基迪奥生物拥有丰富的三代测序项目经验，可以为您提供全面的三代测序研究服务，助力文章发表！感兴趣的老师同学可以联系我们~

参考文献

[1].Wang T, Wang H, Cai D, et al. Comprehensive profiling ofrhizome‐associated alternative splicing and alternativepolyadenylation in moso bamboo (Phyllostachys edulis)[J]. The Plant Journal,2017, 91(4): 684-699.

[2].Kohli M, Ho Y, Hillman D W, et al. Androgen receptor variantAR-V9 is coexpressed with AR-V7 in prostate cancer metastases and predictsabiraterone resistance[J]. Clinical Cancer Research, 2017.

[3].Workman R E, Myrka A M, Tseng E, etal. Single-molecule,full-length transcript sequencing provides insight into theextreme metabolism of the ruby-throated hummingbird Archilochus colubris[J]. Gigascience,2018, 7(3):1-12.

[4].Zhu F Y, Chen M X, Ye N H, et al. Proteogenomic analysisreveals alternative splicing and translation as part of the abscisic acidresponse in Arabidopsis seedlings[J]. The Plant Journal, 2017, 91(3): 518-533.

[5].Wang M, Wang P, Liang F, et al. Aglobal survey of alternative splicing in allopolyploid cotton: landscape,complexity and regulation[J]. New Phytologist, 2018, 217(1): 163-178.

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