溶瘤病毒疗法新突破！

近日，BoXu等在《Nature biotechnology》（IF:35.724）杂志上发表题为“An oncolytic herpesvirus expressing e-cadherin improves survival in mouse models of glioblastoma”的研究论文，创新的使用了非免疫刺激因子类的基因——CDH1（E-cadhein）与HSV-1TK基因搭配，构建了溶瘤疱疹病毒OV-CDH1，能显著增强溶瘤疱疹病毒对脑胶质瘤的治疗效果，同时可以在治疗效果不确定的情况下，通过“刹车”（HSV-1TK/Acyclovir）对病毒进行杀灭处理，提高了安全性。
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CDH1，E-钙粘蛋白

• 由胞外结构域5个钙粘蛋白重复（EC1~EC5），一个跨膜结构域及一个结合p120连环素-和&szlig-连环素胞的内结构域组成。癌症的发展和转移牵涉了E-钙粘蛋白功能的表达或缺失。
  

• 肿瘤转移相关性

  E-钙粘蛋白表达下调降低了一个组织内细胞黏附的强度，导致细胞活 动性（motility）增加，这可以转而允许癌细胞穿过基底膜入侵周围组织(EMT)发生肿瘤转移。

• NK细胞杀伤相关性

  E钙黏蛋白也是一种粘附分子并且也是KLRG1的配体，而KLRG1是在NK细胞上表达的抑制性受体。

HSV-TK，单纯疱疹病毒胸苷激酶

• 是肿瘤基因治疗研究中常用的自杀基因，可以使一些无毒或低毒的前药转化为强细胞毒性物质，杀死肿瘤细胞。

• 含有HSV-TK的病毒，对疱疹病毒治疗药物Acyclovir非常敏感，更容易被杀灭。

oHSV溶瘤病毒构建

一般来说，oHSV在应用方面有两种主要构建策略：

• 一种是通过缺失或失活一些复制基因，来确保病毒只在增殖的肿瘤细胞中复制，但这也约束了病毒的传播和溶瘤能力；

• 第二种策略是修饰病毒本身介导进入细胞的糖蛋白分子，这种方式保持了病毒的复制和生产能力，但是会降低病毒的感染能力。

本文作者使用的溶瘤疱疹病毒（oHSV）采用的是第一种构建策略，在删除了ICP34.5区域插入了CDH1基因（E-cadherin），命名为OV-CDH1，而未携带CDH1基因的对照OHSV命名为OV-Q1。
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OV-CDH1抑制KLRG+NK细胞杀伤

将感染OV-CDH1的肿瘤细胞与NK细胞进行共培养，发现与OV-Q1相比，感染OV-CDH1细胞被杀伤数量降低。将NK细胞分为KLRG+和KLRG-两个亚群分别进行试验发现时，OV-CDH1感染的细胞可使KLRG+ NK细胞CD107a表达降低，并且使其IFN-γ分泌减少。但在KLRG- NK细胞组中未发现两者的差异。这说明OV-CDH1感染细胞表达的E钙黏蛋白与KLRG+ NK细胞上的KLRG受体结合，抑制了这个NK亚群细胞对病毒性肿瘤细胞的杀伤力。
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CDH1促进病毒在细胞间的传播

作者评估了OV-CDH1的传播速度，发现OV-CDH1感染的GBM细胞成斑速度较OV-Q1感染的细胞组更快。对细胞斑进一步染色分析，发现OV-Q1感染的细胞呈现单核，细胞之间的膜边界明显，而OV-CDH1感染的细胞呈现多核形态，细胞膜边界不明显，这表明OV-CDH1感染的细胞进行了融合，而这促进了病毒在细胞间的传播，使成斑速度更快。在模仿肿瘤环境的半固相溶液中，成斑实验得到了同样的结果。使用抗体封闭了E钙黏蛋白额胞外区域后，OV-CDH1细胞的成斑效果明显降低，但OV-Q1细胞无明显影响。突变了E钙黏蛋白胞外区域，得到了与抗体封闭同样的效果，这说明E钙黏蛋白的胞外区域对病毒在细胞中的传播起到重要作用，而且GBM细胞自身表达的N钙黏蛋白在这一过程中与E钙黏蛋白结合，不可或缺。
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CDH1基因促进病毒感染和增殖

用OV-CDH1和OV-Q1病毒同时在Gli36和U251细胞中进行病毒的扩增复制效率检测，结果显示，含有CDH1基因的OV-CDH1病毒复制效率明显高于无CDH1基因的OV-Q1病毒，且通过动力学分析表明，OV-CDH1病毒对细胞的抓力明显强于OV-Q1病毒，这也间接促进了病毒的传播和病毒的产量。     
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OV-CDH1对脑胶质瘤疗效显著

体外实验获得良好的数据后，作者下一步进行体内验证，在GBM裸鼠异种移植瘤模型中，OV-CDH1显著减低了GBM的肿瘤大小（Control vs. OV-CDH1 **P = 0.009; OV-Q1vs. OV-CDH1 *P = 0.024），并延长了中位生存期（90d vs.34d）。紧接着对免疫完全小鼠进行的Gl261N4（GBM细胞系）移植模型中，与OV-Q1对比，OV-CDH1实验组细胞表面大量表达E钙黏蛋白，形态上表现出了明显的细胞融合现象，和更强的病毒传播能力，中位生存期延长（42.5dvs. 32d）。
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刹车机制提升安全性

这种修饰后的溶瘤病毒（OV-CDH1）也存在着安全隐患。如其逃避了NK细胞的追杀，感染OV-CDH1的肿瘤细胞较难被效应细胞清除，以及携带的CDH1会在肿瘤细胞中表达，这其实潜在增强了肿瘤细胞的粘附力等问题。针对这些存在的安全问题，研究者引入了一个“刹车”机制，即OV-Q1和OV-CDH1均携带HSV-1TK基因，使该病毒对acyclovir药物十分敏感，研究者可以根据需要特异性的将其停止。

总的来说，从体内外的最终实验中结果看，过表达CDH1可以显著提升溶瘤病毒对脑胶质瘤的治疗效果。此外，“刹车”机制的引入提高了病毒治疗的安全性，在治疗效果不确定的情况下，可以让病毒药物更加的安全可控。

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