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| 《细胞生物学》系列课程：第二章细胞生物学研究方法 |
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《细胞生物学》系列课程第二章细胞生物学研究方法本章内容：第一节细胞形态结构的观察方法第二节细胞组分的分析方法第三节细胞培养第一节细胞
形态结构的观察方法显微镜是观察细胞的主要工具显微镜分类：光学显微镜技术电子显微镜技术纳米显微技术：扫描隧道显微镜原子力显微镜一、
显微结构的观察——光学显微镜技术光学显微镜是利用光线照明，将微小物体放大成像的仪器。常用种类：普通光学显微镜荧光显微镜相差显
微镜暗视野显微镜共聚焦激光扫描显微镜微分干涉差显微镜……（一）普通光学显微镜——分辨率极限为0.2μm1.结构：①
照明系统②光学放大系统③机械装置标本物镜目镜2.成像原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。总的放大倍数=物镜的放
大倍数×目镜的放大倍数3.分辨率——普通光镜的分辨率极限为0.2μm⑴分辨率(Resolution,R)显微镜所能分辨
的两点间的最小距离各种显微镜的最高分辨率光镜：0.2μm电镜：0.2nm(生物标本:2nm)扫描隧道显微镜：0.1nm肉眼0
.1mm光学显微镜植物细胞电子显微镜动物细胞细菌0.2μm病毒核糖体球形蛋白小分子原子各种显微镜的分辨
率0.1nm物镜R聚光镜⑵分辨率的计算：所以，用可见光作光源的普通光学显微镜，R（最大）＝0.61?/n.sin?
＝0.61×0.5?m/1.5×1＝0.2?m了解数值孔径（N.A）=n.sin?数值孔径的大小代表了光镜
会聚光线的能力。数值孔径越高，影像的亮度越高，光镜的分辨率越大。4.光镜样本的制备取材固定：可使大分子交联而保持在一定位置上，
防止结构移位或丢失。常用的固定液：甲醛、戊二醛包埋：使组织形成硬块，便于切片常用包埋剂：石蜡、树脂切片：由于生物样品太厚，不能直
接用光镜观察，需切成1—10um的薄片染色：增大反差苏木精（碱性染料）核酸hematoxylin几种常用的染色剂伊红（酸
性染料）细胞质eosin苏丹（脂溶性染料）脂肪考马斯亮蓝蛋白质发射光(可见光、荧光)（emiss
ion）激发光（exciting）荧光分子（二）荧光显微镜—可以呈现强反差的彩色图像1.荧光分子（荧光染料）荧光分子的激发与发
射波长两种常用的荧光染料四甲基罗丹明（tetramethyrhodanmine）激发光：黄绿光发射光：红色荧光荧光素（fluore
scein）激发光：蓝光发射光：绿色荧光荧光显微镜观察荧光染料染色或标记细胞内物质荧光分子（自发荧光）叶绿素——红色荧光维生素
A——绿色荧光脂褐素——棕黄色荧光……非荧光分子（诱发荧光）2.荧光显微镜(fluorescencemicroscopy
)结构特点：照明方式多为落射式光源多为高压汞灯有两组滤光片①光源与标本之间仅让荧光染料的激发光通过②物镜和目镜之间仅让荧光染
料的发射光通过尼康E800荧光DIC显微镜目镜第二个滤光片：仅让波长在520-560nm的特异绿色荧光（荧光素的发射光）通过发射
光光源分光镜：510nm以下的光反射，510nm以上的光通过激发光第一个滤光片：仅让波长在450-490nm的蓝光（荧光素的激发光
）通过物镜（荧光素染色）样品荧光显微镜的光学系统成像特点：暗背景，反差强彩色图像检测灵敏度高（分辨力高于普通显微镜）Fluore
scentImageofaCellinMitosis绿色：纺锤体微管红色：着丝粒蓝色：DNA荧光显微镜照片（绿色-微管
红色-微丝蓝色-细胞核）应用：对细胞或组织内的荧光标记物质进行定位或定性、定量研究。运用对细胞内特定离子有特异亲和性或依
赖于细胞内酶的催化作用才能发出荧光的活体荧光染料，可以对活细胞内分子的动态变化进行实时观察。（三）相差显微镜——直视活细胞原理
：入射光利用光的衍射和干涉效应，把透过标本不同区域的光波的光程差变成振幅差，从而使活细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比。应用
：可以直接观察未经染色的活细胞Aphase-contrastmicrographofepithelialcells倒置
相差显微镜——用于观察培养细胞光源和聚光镜在载物台的上方相差物镜在载物台的下方培养的成纤维细胞（倒置相差显微镜）物镜载物台聚光
镜光线挡光片（四）暗视野显微镜——通过散射光成像原理：散射光成像成像特点：暗视野：背景是黑的，物体的边缘是亮的。分辨率不高：
适于观察物体的轮廓，但分辨不清内部的微细构造。普通光学显微镜微分干涉显微镜相差显微镜暗视野显微镜Fourtypesoflig
htmicroscopy应用：适合于观察活细胞内的细胞核、线粒体、液体介质中的细菌和真菌等。Bright-fieldmicr
oscopyDark-fieldmicroscopy（五）显微电影摄影技术——记录细胞或细胞器的运动过程原理：用显微电影摄影术
或电视录像以一定时间间隔拍摄，然后以正常速度放映。应用：准确记录细胞或细胞器的运动过程和速度(六)共聚焦激光扫描显微境—显示细
胞内的3D结构原理单色激光作为光源→点照射只有从标本焦点(聚光点)发出的光线聚焦成像，焦点以外的漫射光不参加成像→图像高清晰逐点扫
描，电脑进行三维重建→显示3D结构检测针孔照明针孔成像特点：高清晰：分辨率是普通荧光显微镜的1.4~1.7倍彩色图像三维图像：能
显示样品内部的立体结构应用：类似于荧光显微镜，多用于检测发射荧光或用荧光标记的物质。果蝇原肠胚表层细胞质内荧光抗体标记的微丝分布
普通荧光显微镜共聚焦激光扫描显微镜CLSM照片，蓝色为细胞核，绿色为微管红色为囊泡理论值：0.002nm实际
值：0.2nm生物样品：2nm电镜的分辨率二、超微结构的观察——电子显微镜技术以电子束作光源，波长短，分辨率高电镜下观察到的结
构称为亚显微结构或超微结构两大类：透射电镜&扫描电镜黄金电镜照片（一）透射电子显微镜（transmissionelectr
onmicroscope,TEM）应用：主要用于观察细胞内部的细微结构总体设计与光镜类似，主要的不同之处：体积大上下颠倒
用电子束作光源用电磁场作透镜镜筒真空电子枪光源聚光镜标本物镜目镜投射镜用眼睛直接观察图像通过荧光屏或相片观察光学显微镜与透射电镜的
光路原理比较透射电镜的标本制备过程取材：尽可能保持生活状态,避免损伤固定：双重固定戊二醛固定蛋白锇酸（四氧化锇）固定蛋白与脂类脱水
：系列梯度的乙醇或丙酮包埋：常用环氧树脂,使样品固化成硬块切片：电子的穿透力很弱，需制作超薄切片（50～100nm厚），然后置于直
径3mm的金属载网（铜网或镍网）上。染色：生物分子散射电子能力弱，需经过重金属染色，增大反差。常用锇、铀、铅等重金属的盐类。豚鼠浆
细胞的电镜照片高压透射电镜电子加速电压＞20万伏特超高压电镜：＞50万伏特优点：电子波长短，分辨率高电子穿透力增强，可观察较厚的
电镜切片(透射)电子显微镜与光学显微镜的基本区别分辨率光源透镜镜筒真空成像原理光学显微镜200nm(0.2μm)可见光玻璃透镜不
要求利用样本对光的吸收形成明暗反差和颜色变化电子显微镜0.2nm电子束电磁透镜要求利用样本对电子的散射和透射形成明暗反差（二）扫描
电子显微镜技术（scanningelectronmicroscope,SEM）20世纪60年代问世比透射电镜小，结
构简单物镜二次电子检测器样品成像原理：通过电子束照射在标本上产生的二次电子成像，二次电子产生的多少与电子束在标本表面的投射角有关
。应用：可以直接观察标本表面的三维形态聚光镜电子束偏转器物镜二次电子样本探测器扫描电镜的工作原理透射电镜扫描电镜扫描
电镜与透射电镜成像原理的不同：透射电镜：透射电子成像扫描电镜：二次电子成像扫描电镜的特点①可以直接观察标本表面的三维形态，图
像的立体感很强透射电镜微分干涉差显微镜扫描电镜牛蛙内耳毛细胞突出的静纤毛鼠的成纤维细胞②放大倍率范围广，可放大十几倍到几十
万倍3T3③样品制备简单，不必做超薄切片④分辨率（3~10nm）不及透射电镜，多用于细胞整体或组织的观察。近几年研制的低压高
分辨扫描电镜分辨率可达0.7nm，可用于观察核孔复合体等更精细的结构。胞质面核质面Figure9-51.Thenuclea
rpore.Rapidlyfrozennuclearenvelopeswereimagedinahigh-re
solutionSEM,equippedwithafieldemissiongunasthesourceof
electrons.⑤应用范围广，样品的适应性大透射电镜与扫描电镜的比较结构成像原理应用样本制备分辨率透射电镜体积大透射电子成
像细胞内部细微结构复杂，需要包埋、制备超薄切片高扫描电镜体积小结构简单二次电子成像样本表面的立体形貌简单，不必制备超薄切片比透射电
镜低（三）透射电镜借助金属投影、冰冻断裂及冰冻蚀刻技术可获取三维图像1.金属投影法（MetalShadowing）2.冰冻
断裂(freeze-fracture)3.冰冻蚀刻(freeze-etching)1.金属投影法通过金属投影，在透射电镜下看
到的肌球蛋白→→2.冰冻断裂(freeze-fracture)应用：观察各种生物膜的内部构造方法：样品快速冷冻（液氮,-1
96℃）→冰刀从脂双层中间撬开→暴露断面→金属投影→制作复型Carbonisaddedtostrengthenrep
licaThinlayerofplatinumissprayedfromthesidetocreateshad
owedreplicaofthesurface3.冰冻蚀刻(freeze-etching)液态氦-269℃真空中升华
脂双层剖面的复型培养细胞内面的深度蚀刻电镜照片，示Clathrin衣被第三章第一节重点掌握：分辨率的概念、公式及公式中各符号的含
义光镜标本制备中固定的作用荧光显微镜的结构特点、二组滤光片的作用透射电子显微镜与光学显微镜的主要区别（表）扫描电镜与透射电镜在成像
原理上的不同扫描电镜的特点各种光镜、电镜的成像特点A型题：扫描电子显微镜可用于A.获得细胞不同切面的图像B.观察活细胞C.定量分
析细胞中的化学成分D.观察细胞表面的立体形貌E.观察细胞的活动观察培养中活细胞的连续生理活动应该适用A.暗视野显微镜B.荧光显微
镜C.倒置相差显微镜D.电子显微镜E.扫描电子显微镜可得到完整的细胞三维结构图像的显微镜是A.普通光镜B.荧光显微镜C.相差显
微镜D.暗视野显微镜E.共聚焦激光扫描显微镜用于生物标本的电子显微镜的分辨率为A.2μm；B.0.2μm；C.0.2nm；D.2n
m；E.2AO关于共聚焦激光扫描显微镜，下列哪项有误A.以单色激光作为光源；B.激光变成点光源后聚焦到标本成为点照明；C.点光
源激光束在标本的整个焦平面上进行光点扫描后在荧光屏上成像；D.图像信息要经过电脑三维重建处理；E.所用标本须经超薄切片X型题冰冻
蚀刻技术的样品制备步骤不包括下列哪些？A.冰冻；B.断裂；C.蚀刻；D.染色；E.超薄切片普通光镜上决定放大倍数的部件有A.
目镜；B.物镜；C.照明灯；D.聚光镜；E.光圈透射电镜具有下列特征A.分辨率高；B.放大倍数高；C.成像立体感强；D
.标本须超薄扫描电镜的基本特征有A.可见细胞表面的三维形态；B.成像立体感强；C.标本须超薄；D.标本表面喷镀金属膜制备电镜超
薄切片不可缺少以下哪些环节A.固定；B.脱水；C.包埋；D.切片下列哪些显微镜适合观察未经染色的活细胞下列哪些显微镜可提供三维
图像下列哪些显微镜可提供彩色图像A.暗视野显微镜B.相差显微镜C.共聚焦激光扫描共焦显微镜D.荧光显微镜E.普
通光学显微镜F.透射电镜G.扫描电镜填空题显微镜根据光源的不同可分为________和___________。光学显微镜由___
_______、__________和__________三大部分构成，普通光学显微镜的最大分辨率为________.荧光显微镜的
照明方式照明方式通常为______式的，光源一般是______。荧光显微镜有两组特殊的滤光片，第一组滤光片位于________，仅
能通过______，第二组滤光片位于_________之间，仅能通过______。高压透射电镜的的加速电压一般在______万伏特
以上，分辨率比普通透射电镜_____，可观察_______的电镜切片。倒置相差显微镜主要用于观察_________。暗视野显微镜适
于观察物体的_______。光学显微镜的分辨率由_______、_______和_______三个因素决定。观察生物膜的内部
结构可采用_____法。电子显微镜按工作原理和用途的不同可分为__________和___________。简答题在显微镜
标本制备中，为什么要进行固定？共聚焦激光扫描显微镜与普通荧光显微镜相比，在成像上有何特点？1.可观察样品内部的三维结构2.分辨
率更高，图像更清晰从分辨率、光源、透镜和成像原理四方面比较光学显微镜和电子显微镜。透射电镜与扫描电镜的成像原理有何不同？什么是分辨
率？请写出光学显微镜分辨率的计算公式及公式中各符号的含义。光镜标本制备的主要步骤有哪些？自发荧光（autoflurorescen
ce）指不经任何处理的组织细胞成分在短波长光照射下发出荧光，如胶原纤维和弹性纤维呈蓝绿色荧光，卟啉呈红色荧光，维生素A发绿色荧光，
细胞内的脂褐素呈棕黄色荧光，蓄积于组织内的某些药物如阿的平和四环素等也能产生荧光。口腔上皮细胞Comparisonofconv
entionalandconfocalfluorescencemicroscopy.Thesetwomicrogra
phsareofthesameintactgastrula-stageDrosophilaembryothat
hasbeenstainedwithafluorescentprobeforactinfilaments.Th
econventional,unprocessedimage(A)isblurredbythepresence
offluorescentstructuresaboveandbelowtheplaneoffocus.In
theconfocalimage(B),thisout-of-focusinformationisremoved,
whichresultsinacrispopticalsectionofthecellintheembr
yo.TheuniversewithinII.3DreconstructionofXpsusingsingle
planeconfocalmicroscopyimages.Differentfluorescentdyeswer
eusedtoidentifydifferentcellularstructures:microtubulenet
work(thecell''sskeleton)isstainedingreen,vesiclesinreda
ndthenucleusinblue.10万伏特，理论值：0.002nm培养的3T3细胞黄色部分：核绿色：细胞质表面还
有不规则的突起Figure9-51.Thenuclearpore.Rapidlyfrozennuclearenve
lopeswereimagedinahigh-resolutionSEM,equippedwithafield
emissiongunasthesourceofelectrons.TheseviewsofeachsideofanuclearporerepresentthelimitofresolutionoftheSEM,andshouldbecomparedwithFigure12-10.(CourtesyofMartinGoldbergandTerryAllen.)?Figure3-24.Electronmicrographsofindividualmyosinproteinmoleculesthathavebeenshadowedwithplatinum.Myosinisamajorcomponentofthecontractileapparatusofmuscle.Asshownhere,itiscomposedoftwoglobularheadregionslinkedtoacommonrodliketail. |
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