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不论是刚进实验室的新人，还是熟门熟路的老鸟，相信只要做过转染，或多或少都遇到过一些糟心事儿，要么细胞不生长，要么压根儿没转入。那些次次转染都成功的，怕不是天选之子，就是幸运星本尊。 当然，大部分人靠运气吃饭是会饿死的，只有提高实验水平才是真 · 出路。下面我们就来详细的了解一下转染，以及它「毁」人不倦的那些坑。 什么是转染？ 转染是指将外源 DNA 或 RNA 片段导入到真核细胞而获得新的遗传标志的过程。一般转染技术包括两大类：瞬时转染和稳定转染。 就瞬时转染而言，转染的 DNA/RNA 没有整合到宿主基因组中，所以外源 DNA/RNA 将会在后续的细胞有丝分裂过程中丢失。外源基因的表达是短暂的，通常只持续几天，但表达效率高，导入的高拷贝 DNA/RNA 会产生高水平的蛋白表达。 对于稳定转染，通常我们又称为永久转染，外源 DNA 能整合到宿主基因组，因此转染的宿主细胞及其子代细胞的基因组中会同时保留外源 DNA 片段。外源基因整合到染色体中的概率很小，单拷贝或低拷贝稳定整合的 DNA 会导致低水平的蛋白表达。稳定转染的转染效率只有瞬时转染的 1~10％，且适用于使用带有诱导型启动子的载体研究。 常见的转染方法 常见的转染手段有物理方法、化学试剂和生物介导三大类。如电转染、显微注射、磷酸钙共沉淀、病毒转染等。 不同的转染方法各有千秋（见表 1），使用哪种方法需要综合考虑很多因素，如细胞类型（原代细胞 / 细胞系），细胞来源（体内 / 体外 / 离体），外源基因负载量，转染效率，安全性，成本，时间等。 表 1. 常用转染方法及其特点概述（部分） 转染的影响因素 转染过程中许多因素会影响转染效率：如细胞种类、细胞密度；质粒大小、质粒纯度；血清；抗生素；转染试剂等。 转染实验中，以下几个因素需多加注意。 1. 转染前的细胞状态和密度 转染时细胞密度以 70~90%（贴壁细胞）或 2×106~4×106细胞 / mL（悬浮细胞）为宜，细胞密度过高会严重影响细胞状态（周期进程阻滞，凋亡增加等）。转染效率随着细胞传代次数不同会发生很大变化，因为传代次数少的细胞转染率非常低，而对传代次数较多的细胞而言，其转染最佳剂量差别较大。同时支原体污染会严重降低细胞的转染效率，因此转染前可用环丙沙星处理细胞以除去支原体。 2. 转染时的质粒纯度 假使质粒不纯，如带少量盐离子，蛋白、代谢物污染等都会显著影响转染复合物的有效形成；而含有内毒素的质粒对细胞存在很大的毒性作用。抗生素一般对真核细胞无毒，但转染过程中细胞通透性增加，使抗生素进入细胞，从而降低细胞活性，导致转染效率低下。 3. 转染后的筛选时间 转染后筛选不能太早或太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷大，增殖较慢，太晚会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆。一般要在转染 48 h 之后开始加抗生素筛选。 图1. 转染流程示意图 4. DNA 与转染试剂的比例 许多转染方法需要优化 DNA 与转染试剂的比例。不同细胞系转染效率通常不同，细胞系的选择通常根据实验需要确定。在转染前应根据实验要求和细胞特性选择合适的转染试剂，不同转染试剂转染效率差别很大，好的转染试剂能让您事半功倍。 北京义翘神州 （Sino Biological Inc.） 自主研发的Sinofection® 是一种优良的阳离子聚合物转染试剂。具有细胞毒性低、转染效率高和重复性好等优点。适用于贴壁细胞、悬浮细胞转染以及有血清和无血清的转染条件。通用性好，适用于多种细胞系。 免费试用 目前，高效转染试剂 Sinofection® 免费试用活动火热进行中，长按下方二维码识别或点击文末「阅读原文」立即申请。 文章来源：义翘神州 |
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