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在该研究中发现了一种突变p53的微环境GOF(gain oncogenic functions)机制，通过驱动肿瘤和免疫细胞之间的基于外泌体的通信，形成了一个肿瘤支持性巨噬细胞的不同亚群。其中miR-1246作为mutp53分泌外泌体中的独特的分子，可能在结肠癌的诊断和治疗中发挥作用。 文章题目：Mutant p53 cancers reprogram macrophages to tumor supporting macrophages via exosomal miR-1246 研究人员：美国国立卫生研究院 发表时间：2018.02.22 期刊名称：Nature Communications 影响因子：10.124研究背景 TP53基因（编码p53蛋白）突变是人类癌症中最常见的遗传改变之一。有报道提出，突变的TP53基因（mutp53）除了消除由p53介导的肿瘤抑制作用外，还有一组不同的错义突变可以赋予突变p53蛋白一种功能获得（GOF）的新活性，GOF活性主要通过与其他分子蛋白的交互作用显著改变肿瘤细胞的特征，调节肿瘤细胞的转录过程。在细胞水平上，mutp53蛋白稳定性的增加导致肿瘤细胞内mutp53大量积累，进而破坏细胞稳态，创造致癌压力。因此，肿瘤细胞的生存以及致癌性质似乎依赖于高水平的 mutp53。 在大多数实体瘤中，肿瘤基质的一个主要组分是巨噬细胞，被称为肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），TAMs大多是由外周血单核细胞进入中路基质中形成的。近年来，TAM已经被广泛研究并认为是促进肿瘤进展的重要影响因素。研究人员推测是通过免疫调节巨噬细胞相关的蛋白和microRNAs的核外传递来介导肿瘤细胞与巨噬细胞之间的通信作用。 研究方法 研究者首先通过体外共培养巨噬细胞和mutp53肿瘤细胞并检测相关细胞因子来验证mutp53肿瘤细胞可以重编码邻近巨噬细胞这一机制，然后对肿瘤细胞分泌的外泌体进行分离研究，发现miR-1246等相关miRs在mutp53肿瘤细胞分泌的外泌体中富集表达。然后进一步验证了miR-1246和mutp53之间的关联以及miR-1246和mutp53的肿瘤支持能力。 然后研究者对该研究的临床相关性进行探究，对43名结直肠癌患者的所有外显子进行测序分析mutp53与TAMs的相关性，通过microRNA表达分析和原位杂交分析验证miR-1246与mutp53的相关性。 研究成果 1.含有mutp53的肿瘤细胞重编码巨噬细胞 研究者分析TP53基因含有特定突变的肿瘤细胞可能会重编码邻近的巨噬细胞这一机制。将起源于CD14+主要人类单核细胞通过3种刺激性细胞因子诱导为M0巨噬细胞，M1巨噬细胞，M2巨噬细胞。对于共培养的肿瘤细胞隔室，研究者选择了几种mutp53表达的细胞模型（HCT116细胞中的R248W突变体），诱导（H358细胞中的V157F，R175H，R273H或R249S）或敲除（ HT29细胞中的R273H）。使用先前报道过的在TAM平衡中有所改变的一组细胞因子来监控mutp53对共培养巨噬细胞的影响。 结果发现，相较于巨噬细胞与缺乏mutp53或者mutp53敲除的细胞共培养，等量的巨噬细胞暴露于含有mutp53的细胞中时，M0和M2巨噬细胞的IL-10，CCL2和VEGF等细胞因子表达量增加，而TNF-α表达量减少。分泌细胞因子的蛋白质谱分析证实，当mutp53存在于肿瘤细胞中时，M2巨噬细胞产生较少的促炎细胞因子，如IL-8，IFN-γICAM-1。此外，发现TAM的两种标记物CD206和CD263在mutp50重编程的巨噬细胞的表面的占据有所增加，这些重编程的巨噬细胞还具有增强的细胞外基质降解能力，且变得更加活泼和更具有侵入性。 图1 携带mutp53的肿瘤细胞对巨噬细胞施加一种非细胞自主性影响 2.mutp53肿瘤细胞分泌的外泌体中携带一种特定的miR标签 由于前面所研究的M0和M2巨噬细胞的mutp53驱动的重编程过程发生在没有细胞与细胞接触的情况下，然而假定的亚细胞材料交换是发生在肿瘤细胞和巨噬细胞之间的，为了研究这种细胞间交流被调节的机制，研究者主要研究由mutp53肿瘤细胞分泌的外泌体。 研究者从HCT116和HT29细胞中分离和鉴定了外泌体，通过western印记和质谱分析确定了核外标记蛋白的存在，Calnexin作为标记物表明过滤分离不存在细胞污染，纳米粒子追踪分析和透射电子显微镜验证了外泌体的大小和形状。 对纯化的外泌体进行RNA提取，发现其主要类别是小RNA。由于microRNA是通过外泌体转移并进行信号传导的主要RNA类型，研究者对HCT116和HT29细胞外泌体进行miR芯片测序分析，比较在mutp53肿瘤细胞、野生型p53肿瘤细胞以及无效p53细胞所分泌的外泌体中表达富集的miRs，并将结果标准化为表达量最高的100个miRs。结果发现miR-1246和miR-21等miRs在mutp53 HCT116和HT29细胞分泌的外泌体中富集表达。 图2 由肿瘤细胞分泌的外泌体被邻近的巨噬细胞所摄取 3.核外miR-1246与mutp53在肿瘤细胞和TAM中有所关联 然后，研究者用来确定包含miR-1246的外泌体是否从肿瘤细胞转移至邻近的巨噬细胞。结果发现，在共培养的M0和M2巨噬细胞暴露于mutp53肿瘤细胞时，miR-1246的表达量有所增多；只有在巨噬细胞与mutp53细胞纯化的外泌体共培养时，细胞内miR-1246水平才会有所增高。用锁核酸(locked nucleic–acid)miR-1246模拟物在M2巨噬细胞中表达miR-1246来验证以上结果，发现与共培养结果一致，存在巨噬细胞重编程现象。 图3 mutp53肿瘤细胞分泌的外泌体中携带特定的microRNA 4.mutp53引起依赖miR-1246的巨噬细胞重编程 为了验证mutp53重编程巨噬细胞的肿瘤支持能力，研究者将M2巨噬细胞和mutp53 HCT116细胞共培养，然后将共培养的巨噬细胞与新鲜的肿瘤细胞混合作为移植瘤皮下注射进NOD-SCID小鼠中。结果发现相比于注射前暴露于野生型p53肿瘤细胞的巨噬细胞，共注射的mutp53重编程的巨噬细胞推动了更大程度的肿瘤发展并增加了转移负荷。此外，研究发现M2巨噬细胞具有更强的肿瘤支持能力。 然后，研究者评估了miR-1246在TAM中的肿瘤支持能力。M2巨噬细胞被miR-1246模拟物转染，然后与HCT116或HT29细胞共注射在NOD-SCID小鼠中形成肿瘤。与模拟对照相比，共注射转染了miR-1246的M2巨噬细胞的肿瘤产生明显更大的肿瘤，并且增加了肺和肝脏的转移负荷。 图4 miR-1246与mutp53相关，并在重编程TAM中发挥作用 5.结直肠癌患者的mutp53与TAMs呈正相关 接下来，研究者进一步评估了该研究结果的临床相关性。对43名结直肠癌患者的所有外显子进行15000x的测序分析，将肿瘤分为p53错义突变组mutp53和p53没有错义突变的WT组/WT+ Indels组。免疫组化分析表明在mutp53病例中存在更为强烈的扩散的核p53染色。与共培养的结果一致，TAM标志物（CD163和CD206）在肿瘤基质中呈阳性染色，尤其是在mutp53病例中。此外，还发现CD163和CD206阳性细胞主要位于这些肿瘤细胞的侵入性前沿区域。用GSEA对mRNA表达进行分析,鉴定在mutp53肿瘤组中上调的编码和非编码基因的标签，发现一般的炎症性分子标签在mutp53组中过表达，一些特定的“替代巨噬细胞极化”标志基因表达量上调。此外，通过分析mutp53患者与WT+Indel患者的生存率，发现携带GOF p53突变体的肿瘤细胞与其微环境之间的相互作用可能会导致预后不良。 图5 在结直肠癌患者中，mutp53与TAM正相关 6.结直肠癌患者的mutp53与miR-1246呈正相关 接下来，研究者验证了癌症患者中miR-1246与mutp53的关联，从27个WT p53和28个mutp53结直肠癌患者中提取RNA，进行microRNA表达分析。比较WT和mutp53肿瘤之间的表达水平时，发现miR-1246是与mutp53肿瘤相关系数最高的mircoRNA，通过原位杂交分析发现mutp53患者肿瘤呈现出更高的阳性染色。为了验证在mutp53结直肠癌患者中，miR-1246转移至巨噬细胞，研究者实施了两步免疫荧光过程，确定了miR-1246和CD206巨噬细胞在mutp53肿瘤中的关系。 图6 在结直肠癌患者中，Mutp53与miR-1246存在一定的关联 7.mutp53结直肠癌患者中的TGF-β信号和免疫抑制 由于TGF-β是免疫抑制调节性T细胞的主要诱导源，在mutp53重编程的TAM中过度分泌，研究者对几个免疫成员进行免疫组化分析。结果发现mutp53相关的TAM细胞群体和Treg细胞呈正相关。在对CRC群体的基因表达进行富集分析中发现一些基因在GOF p53突变组中表达上调，在不同的基因组中，有一些特定的炎症性分子标签在GOF群体中显著改变。TGF-β信号通路中的特定基因也与GOF组呈正相关。由于miR-1246能够诱导M2巨噬细胞分泌TGF-β，研究者提出了一个分子模型，其中携带miR-1246的外泌体从mutp53肿瘤细胞中释放，被邻近的巨噬细胞内化，进而重新编程并产生抗炎作用和肿瘤支持因子，因此这些mutp53重编程的巨噬细胞能够诱导抗炎微环境，恢复免疫抑制性Tregs并促进肿瘤发展。 图7 在mutp53 CRC患者中，TGF-β信号和免疫抑制作用有所增强 文章总结 在该文章中，研究人员发现了一种非细胞自主性机制，即人类的Mutp53肿瘤细胞可以将巨噬细胞重编码为肿瘤相关巨噬细胞，具有肿瘤支持性和抗炎症的特性。携带GOF的 mutp53的结直肠癌肿瘤细胞选择性地释放富含miR-1246的外泌体，邻近的巨噬细胞摄取这些外泌体进而引发miR-1246依赖性重编程为癌症促进状态。Mutp53重编程的TAMs有利于抗炎症性的免疫抑制并具有增加的TGF-β活性。这些研究结果表明了mutp53在参与免疫系统促进肿瘤发展和转移的过程中发挥一种微环境GOF的作用。 小编评论 TP53基因突变是大多数肿瘤中一种常见的突变，可以通过消除p53蛋白的肿瘤抑制作用在肿瘤的发生发展过程中发挥作用，也有报道指出突变p53蛋白可以获得一种功能获得的新活性。在该研究中，研究人员通过对mutp53肿瘤细胞进行分析发现了mutp53肿瘤细胞可以通过分泌的外泌体中的miR-1246在肿瘤细胞和巨噬细胞之间建立通信作用，进而将巨噬细胞重编码为肿瘤相关巨噬细胞，在肿瘤的发生发展过程中发挥作用。此外，研究人员还在结直肠癌的肿瘤细胞中进行临床相关性验证。该研究可能对结肠癌的治疗和诊断应用具有一定的指导意义。
参考文献： [1] Tomer Cooks, loannis S. Pateras, et al. Mutant p53 cancers reprogram macrophages to tumor supporting macrophages via exosomal miR-1246[J]. Nature Communications,2018. |
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