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该篇文章综述通过结合将近250篇已有文献报道，讨论了ctDNA在肿瘤早期预测，分子图谱和动态监测等等方面中的应用情况。 文章题目：Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA 研究团队：Cancer Research UK，Clinical Trials Unit and so on. 发表时间：24 February 2017 期刊名称：Nature Reviews Cancer 影响因子：37.147 研究背景 自从1948年 Mandel and Métais 在血液中首次发现了cfDNA后，人类便开始了对血液游离DNA的探索。最初发现正常人每毫升血浆里面大概有1 ~10 ng的cfDNA。而后在1977年肿瘤病人体内发现了更高浓度的cfDNA。后来又在不同的生理状况和临床时期也发现了高浓度的cfDNA存在，例如剧烈运动和炎症等条件下血液中的cfDNA含量都会发生变化。1969年 Thomas Ashworth发现CTCs存在。后来在孕妇的血浆中发现胎儿的DNA序列，继而衍生出一系列的产前诊断的临床应用(NIPT等等)。1994年KRAS突变序列第一次在胰腺癌患者的血液cfDNA中发现，随之开启了ctDNA的研究时代。2012年高深度多基因panel测序的开始，使得在一次试验中检测多种肿瘤相关基因成为可能。 目前液体活检主要的应用领域是肿瘤的血液检测，即利用血液中检测到ctDNA来揭示肿瘤的进展和对药物的反应，进一步精准指导个性化用药治疗等等。随着实验和信息分析技术的进步，液体活检临床应用的技术优势越来越明显。虽然关于ctDNA的生物学研究目前还不是十分明确，但是当前是一个十分令人兴奋的时期，因为ctDNA正在开始应用于临床，并使人获益。 ctDNA的肿瘤应用研究概况 ctDNA的临床应用研究进展大致如Figure1a：ctDNA在肿瘤病人的各个时期进行监管治疗。临床应用大致基于Figure1b的两大部分ctDNA分析信息(在预后的检测分析中，还可以评估耐药性的出现和定量残留疾病)。 Figure1. ctDNA的临床应用研究与分析 从生物学上来认识cfDNA和ctDNA等循环遗传物质 人体的血液中包含从各个组织中释放出来的cell-free DNA (cfDNA) and RNA (cfRNA); proteins; cells; and vesicles (such as exosomes)。cfDNA除了来自细胞凋亡，坏死和分泌到血液中的DNA，还存在于其他一些体液中，像尿，脑脊髓液，胸腔积液，唾液等等。对cfDNA在基因组和表观修饰方面的研究，可以追溯其来源。例如甲基化的分析，就揭示了大部分的cfDNA来源于正常人的造血细胞。研究表明cfDNA的半衰期在16 minutes and 2.5 hours，这样cfDNA的研究就像一台实时照相检测手段。cfDNA的峰值长度在166bp左右（大约147bp的缠绕核小体的DNA长度+链接H1组蛋白的DNA长度=166bp），在血液里，ctDNA的长度小于没有发生突变的cfDNA的分子长度，为什么长度会偏短的机制现在还不是很清楚。cfDNA在免疫和细胞传递等方面都发挥着重要的作用。 1983年Pan and Johnstone 首次发现并描述了外泌体，外泌体由多种类型细胞释放到细胞间隙和体液中，长度大约在40-100nm。外泌体可以通过密度梯度离心，超高速离心和表面标志物等方法提取获得。外泌体在细胞之间的信息交换中起着关键的左右。在外泌体中含有蛋白质和一些列的核酸（DNA, mRNAs, and miRNAs），研究表明他们可以调节受体细胞的活性。更有研究显示exosomal miRNAs能够刺激血管形成和远端转移。它的优势在于循环的遗传物质量比较大，适合ctDNA含量少的疾病研究。 ctDNA的分析策略 ctDNA的分析策略包括单点或多重PCR，目标区域捕获测序和WGS。三种分析策略的特点与比较详见table1： table1：ctDNA分析策略的特点与比较 注： 1】特异性等位基因PCR使得hotspot突变的分析变得十分灵敏。 2】targeted sequencing：可在等位基因频率小于0.1%时检测出ctDNA。 3】sWGS（shallow WGS）只能检测到等位基因突变的5%-10%的片段，所以不适合应用于疾病的早期研究上。更适合于婴儿的染色体异常筛查和肿瘤相关的拷贝数变异检测。 4】由于血清中含有大量的免疫细胞污染，因此使用血浆作为样本效果更佳。 具体的分析研究与应用 1、肿瘤不同时期ctDNA的检测 研究表明血浆中ctDNA 的含量和肿瘤的大小、分期有一定相关性。当然这种相关性也不是绝对的。一项关于640个不同类型和时期的肿瘤患者的研究表明，IV期的ctDNA浓度中位数是I期的100倍。定量研究显示I期患者每5ml血浆中的ctDNA突变拷贝数小于10个，但在部分晚期患者中却是100-1000个拷贝数左右。最近一项研究，ctDNA的水平与复发性高级别的浆液性卵巢癌肿瘤体积大小密切相关。肿瘤体积每增加1 cm³，ctDNA等位基因的突变频率会增加0.08%。此外还有很多研究表明，预后可以检测到ctDNA的患者比没有检测到的患者预后差。除了定量研究，对ctDNA突变频谱的研究可将患者按照不同的分子亚型进行分类，进行精准预后。 2、ctDNA 在疾病的早诊中的应用 疾病的早期诊断（尤其是在转移前）有助于进行疾病的早期干预并提高预后生存质量。疾病的突变在唾液和血液中可先于临床诊断2年被检测出来。 但是肿瘤的早筛仍存在很多问题。一项基于多种类型肿瘤进行ctDNA检测的研究表明，在IV期的患者中有82%的ctDNA检出，但在I期患者中只有47%检出。droplet dPCR (ddPCR) 应用于乳腺癌早期突变筛查灵敏度可达到93.3%，但在针对非小细胞肺癌I期患者的ctDNA检测中，突变在患者血浆中的检出率为50%。可见不同类型的肿瘤早诊的检出率是有差异的。还有研究显示病毒相关的肿瘤，检测病毒在cfDNA中的情况可能会比ctDNA更能提早预知疾病。 随着实验和分析技术的发展提高，生物学和基因组的因素开始变为ctDNA 研究上最大的限制条件。在正常人中发现肿瘤相关基因突变等现象，都需要后续研究他们的生物学和临床上的意义。 3、肿瘤的发病定位 在肿瘤筛查早期，甲基化和核小体的占用模式信息可以帮助定位肿瘤原发灶的位置（何种组织和何种细胞）。一项研究成功运用该技术发现患者患有滤泡性淋巴瘤。 4、Noninvasive molecular profiling 4.1 克服肿瘤的异质性 肿瘤的异质性在近年来已经得到了共识。同一患者不同部位，转移和原发组织也都存在异质性。取很多组织活检样品进行研究几乎是不可能的，而少量点取样的结果又不能正确反映基因突变情况，指导后续的个性化用药就会存在偏差。ctDNA的优点在于能够避免肿瘤内部异质性和不同部位的肿瘤之间的异质性。 4.2 热点突变和gene panel ctDNA检测突变和组织中检测突变的一致性大概在65%-98%。 4.3 结构变异 一项关于80个前列腺癌病人的研究表明，雄激素受体的拷贝数增加的样品药物治疗之后预后比较差。 注：1】Copy number alterations can be detected in cfDNA using WGS, amplicon-based and hybrid-capture approaches. 2】Chromosomal rearrangements in plasma can be identified through both WGS and hybrid-capture sequencing approaches。 5、纵向长期监测 治疗效果和ctDNA的动态变化联系紧密且迅速，这种动态变化的ctDNA检出时间一般会比临床确诊要早很多。如在乳腺癌患者治疗过程中，ctDNA浓度随化疗过程而变化，这种反映疗效的变化趋势比其它其它检测手段要早，ctDNA对乳腺癌复发的提示时间也要比影像学、血液检查（如CA15-3）等技术早。同样的研究结果在复发性卵巢癌中也存在。 7、微小残留和复发监控 在治疗和术后发现ctDNA，这样的肿瘤患者可能有着更高的复发风险和更低的生存率。对高风险的患者采取相应的辅助治疗，从而使其获益。这也使得肿瘤复发和转移的早期监控成为可能。 在肿瘤监测的时候，病人特有的一些结构变异更适合作为监测对象，因为结构变异相对于点突变而言更精确灵敏，受噪音影响比较小。日后根据病人的实际突变情况设计个人panel进行应用研究有望成为可能。 8、克隆进化和耐药研究 ctDNA能够检测肿瘤的克隆进化和发现对治疗耐药机制的产生。多阶段多点的液体活检可用于肿瘤的治疗过程对药效的监控，一旦耐药突变产生，有助于及时调整治疗方式，实施精准用药。 Figure2. ctDNA动态监测调整治疗方式 目前问题和未来的方向 随着ctDNA和cfDNA的起源和生物学意义逐渐深入了解，ctDNA在药物发展，肿瘤内部异质性和克隆进化等方面都将发挥着更大的作用。但是现阶段我们对cfDNA的释放等机制还不是很清楚，很多现有的问题现象还得不到很好的解释。在克隆进化方面，不清楚是所有的亚克隆都释放到血液里面还是会受到一些肿瘤血管和代谢的影响。对于罕见突变的检测灵敏性不高，还需实验和信息分析技术的进一步提升。关于循环核酸，蛋白和多种体液的研究（多组学的研究关联分析，如 mRNA and microRNA）能够增强检测的精准性和敏感性，势必是未来的研究发展方向。 参考文献： [1] Jonathan C. M. Wan,Charles Massie,Javier Garcia-Corbacho, et al. Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA[J].Nature Reviews Cancer, 2017,17:227-238.
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