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研究背景 细胞衰老是针对严重的细胞损伤（如致癌活化或者化疗DNA损伤）而执行的一种破损安全程序，通过排除潜在受损细胞的进一步增殖来保护机体的完整性，并且在器官发育期间还具有组织自稳态的生理功能。衰老已被证明可以取消Ras-/Raf驱动（预）癌前病变的促致瘤潜能，并有助于体内抗癌化疗的结果。干细胞功能，统称为“干性”和衰老可能是由重叠的信号网络共同调节。衰老相关的关键信号分子（例如Bmi-1，p16Ink4a，p21Cip1或p53）可以通过防止过早的耗竭而在干细胞维持中起到关键作用。衰老强化p53（Trp53），Cdkn2a（Ink4a或Arf）或Suv39h1编码的基因产物提高了正常细胞有效转化为诱导性多功能干细胞的初始屏障，表明在衰老和干细胞信号通路之间存在着一定的相互影响，且有待进一步的研究。由H3K9甲基转移酶Suv39h1介导的三甲基化H3K9通过在S期相关的E2F靶基因附近建立转录抑制性异染色质标记来研究衰老，并且反映了诱导多功能干细胞重编程相关的表观遗传学原理。使用与癌症无关的诱导型重编程小鼠模型，包含很多衰老细胞，以前的研究已经表明，这些衰老细胞的分泌因子促进了其邻近细胞的重编程。衰老是否促进癌症干性还未曾研究清楚。该研究报道了肿瘤细胞进入类干性状态后的衰老诱发的细胞内在重编程过程，并在从化疗诱导的衰老细胞周期中强制释放或者自发逃逸后获得肿瘤起始能力。 研究方法 样本选择：
研究成果 由强烈的衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性和其他先前显示的衰老标记所显示的，一个原发Eμ-Myc转基因Bcl2过表达淋巴瘤（以下称为对照; Bcl2淋巴瘤）治疗诱导衰老（TIS）的成熟模型。首先，研究者分析了12对Bcl2淋巴瘤的基因表达谱中的干细胞相关转录物，在体外暴露于化疗剂阿霉素（ADR）或未处理的Bcl2淋巴瘤均进入TIS。使用基因组富集分析（GSEA）发现之前建立的成人组织干细胞（ATSC）标记强烈倾向于在TIS组富集，但没有发现在接受ADR治疗且没有衰老的Suv39h1-； Bcl2淋巴瘤中富集（图1a）。在衰老诱导时，几乎整个群体都对干细胞抗原Sca1和衰老标记H3K9me3具有双阳性反应（图1b，顶部）。此外，与非衰老细胞不同，TIS细胞醛脱氢酶（ALDH）和ATP结合盒转运蛋白的活性有所增加（图1b，底部）。当评估不同来源的人类恶性肿瘤时，研究者发现干细胞相关转录物在TIS细胞系和原发性B细胞慢性白血病（B-CLL）患者的样品中有选择性地上调（图1c） 。此外，干性的获得也可以在不同组织类型细胞的癌基因诱导和复制衰老过程中发现（图1d）。因此，小鼠和人癌细胞在进入细胞衰老后均获得新的干细胞特征。 图1 治疗诱导的衰老肿瘤细胞获得表型和功能多样性特征 为了测试衰老相关干性（SAS）是否转化为不同的肿瘤行为，研究者生成了可转换的模型系统（使用4-羟基他莫昔芬（4-OHT）。只有当暴露于4-OHT和ADR时，才会进入全面的衰老状态，干细胞相关转录物和蛋白质含量也有所增加（图2a）。改用ADR和无OHT的培养基，关掉Suv39h1或p53后，单细胞分析显示衰老细胞在几天内恢复了可持续增殖。也就是说，它们成为第一批对保留的荧光衰老标记和5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）双重阳性的细胞，表明DNA合成过程重新开始（具有增殖抑制H3K9me3标记逐渐消失）， SA-β-gal活性最终丧失，S期活性完全恢复（图2a）。因此，原则上衰老是可逆状态，当必要的维持衰老的基因不再被表达时尤其明显。重要的是，与等剂量化疗的相同淋巴瘤的未衰老的细胞相比，这种先前衰老的细胞在克隆形成实验中明显导致更多的克隆，反映在衰老过程中作为潜在程序获得了干性（图2a，b）。先前衰老细胞增强的克隆形成能力在长达100天的延长观察期内是稳定的（14次连续重复;图2b）。 p53-ERTAM作为另一种可诱导的衰老标志物获得了类似的结果。值得注意的是，先前的衰老细胞再次暴露于4-OHT和ADR时通常保留重新进入TIS的能力，表明在先前的衰老细胞中未发生对衰老-妥协突变的选择。 成对的未衰老与先前衰老的淋巴瘤之间的富集分析证明了先前衰老的淋巴瘤在体外和体内的较高生长竞争力。体内肿瘤发生实验发现，与未衰老的淋巴瘤相比，先前的衰老性淋巴瘤在免疫活性受体小鼠的移植细胞数量低得多的情况下产生了恶性肿瘤（图2c）。SAS程序在从TIS释放后对肿瘤起始发挥其有害作用，从而揭露了衰老过程的意料不到的肿瘤起始能力。 图2 衰老释放的淋巴瘤相较于从未衰老的部分具有更高的肿瘤起始能力 为了研究是哪些关键干性通路驱动SAS，我们用GSEA对暴露于ADR的对照组和Suv39h1-;Bcl2淋巴瘤组的某些关键信号通路的基因集进行分析，包括Notch，Hedgehog和典型和非典型Wnt等信号通路。典型Wnt和Notch信号通路在某种程度上在TIS上显著富集。由于Wnt信号通路在包括造血系统在内的许多组织的干细胞更新中发挥关键作用，可以诱导Notch信号传导，并且是血液系统恶性肿瘤干细胞发育所必需的，因此研究认为Wnt级联的激活可能是TIS淋巴瘤中获得干性特征的驱动因素。实际上，我们在对照组检测到增强的主要的核表达和β-连环素的转录激活，然而在Bcl2淋巴瘤以及具有ADR治疗后的TIS人肿瘤细胞系中没有检测到（图3a）。与Wnt配体受体刺激无关，我们通过活化的MEK-MAPK和PI3K-Akt信号通路发现对β-连环素蛋白降解促进糖原合酶激酶3β（GSK3β）的抑制作用。相较于未衰老的细胞，先前衰老过的细胞的Wnt过程的实现被干细胞启动子和Wnt信号相关基因处的表观重塑更进一步的推动了（图3b）。因此，我们发现以前衰老的淋巴瘤或结肠癌细胞增加的克隆形成能力依赖于Wnt信号传导（图3c）。与从未衰老的细胞群体相比，仅在先前衰老的细胞中检测到罕见分裂和强β-连环素表达亚群并维持在稳定状态，解释了先前衰老细胞的持久增强的克隆形成能力。 图3 在TIS中激活的典型的wnt信号是增强衰老释放肿瘤细胞的肿瘤起始能力的关键驱动因素 重要的是，作为发挥干细胞潜能的先决条件，细胞周期重新进入TIS，不仅局限于有条件的可转换系统，也有可能作为罕见事件自发发生在对照组Bcl2淋巴瘤中，例如从SA-β-gal单项阳性衰老细胞群中出现EdU-共阳性细胞。考虑到它们的干细胞潜能，我们假设β-连环素阳性的先前衰老细胞可能在化疗后进展的淋巴瘤中富集。因此，在对治疗前原发对照组Bcl2淋巴瘤与暴露于衰老诱导后复发的相同个体淋巴瘤进行比较时，我们发现复发淋巴瘤中核β-连环素阳性细胞的比例很高，Wnt靶基因的表达水平也较高（图3e，f，左）。此外，对诊断为弥漫性大B细胞淋巴瘤的同一个患者化疗前和疾病复发的纵向匹配活检表明在化疗后复发的样本中出现更多的核β-连环素阳性肿瘤细胞（图3f，右），进一步证明在复发肿瘤中激活的Wnt信号传导以及与衰老相关的肿瘤细胞重编程。综上所述，TIS相关干性反映了Wnt治疗能力，其稳定地维持在重编程的，等级组织的衰老后肿瘤细胞亚群中，与肿瘤进展过程和治疗失败密切相关。 由于推测应用于包括侵袭性淋巴瘤在内的多种人类肿瘤，Eμ-Myc转基因小鼠淋巴瘤不是来源于癌症干细胞的一个独特部分，几乎所有的淋巴瘤细胞在该模型中都具有肿瘤起始能力。因此，接下来研究者对细胞衰老是否可能用于解释非肿瘤干细胞重新编程为肿瘤干细胞，在肿瘤类型中肿瘤启动能力仅限于稀有亚群。我们从由致癌KrasG12D驱动的T细胞急性淋巴细胞白血病的小鼠模型和通过强力霉素控制的shRNA的条件性失活p53分离出非自我更新的白血病细胞群（shp53）。仅当p53表达未被消除时，ADR暴露诱导大多数非干细胞白血病细胞的衰老。该组表现出推定的白血病干细胞的Kit+Sca1+细胞的显著转化，以及干细胞相关的转录本的高表达（图4a）。通过敲除p53从TIS释放，这些白血病细胞恢复增殖，并且与其相同的ADR处理的从未衰老的细胞相比形成明显更多的克隆。正如TIS淋巴瘤所报道的，在衰老的白血病细胞群体中几乎完全可检测到具有核β-连环素表达的细胞，并且Wnt抑制剂完全中和其先前衰老后代的增加的克隆形成能力。几乎所有先前衰老细胞的样品都在受体小鼠中引发白血病。正如预期的那样，所有的Lin-移植产生白血病。在癌基因诱导的衰老结肠粘膜细胞或黑素细胞中进一步加入SAS，发现TIS重编程不限于淋巴起源的细胞。因此，细胞衰老不仅与具有预先存在自我更新能力的肿瘤细胞中的额外干细胞特征相关，还催化淋巴和非淋巴来源的非干细胞本体肿瘤细胞的细胞自主重编程成为新的癌症干细胞。 图4 细胞衰老促进新创non stem大量白血病细胞重编程为肿瘤起始细胞 总结 细胞衰老是一种应激反应的细胞周期阻滞程序，可终止（预）恶性细胞的进一步扩张。衰老机制的关键信号成分，如p16INK4a，p21CIP1和p53以及组蛋白H3的三甲基化赖氨酸9（H3K9me3），也作为干细胞功能（以下统称为“干性”）的主要调控者发挥作用。在癌细胞中，干性的获得可能对肿瘤侵袭性和临床结果具有深远的影响。在该研究中，研究者调查了是否化疗引起的衰老可能会改变恶性细胞相关的的干细胞性能。通过基因表达和功能分析等方式对Eμ-Myc转基因小鼠的衰老和未衰老的的B细胞淋巴瘤进行比较发现成年组织干细胞标记，激活的Wnt信号传导以及衰老中不同的干细胞标志物的显著上调。使用基因可切换的靶向H3K9me3或p53的衰老模型模拟从被捕条件中自发逃脱，研究发现与化疗后没有衰老的细胞相比，从衰老中释放重新进入细胞周期的细胞具有显著增强的Wnt依赖的克隆生长能力。在体内，这些先前的衰老细胞呈现出高得多的肿瘤起始可能性。该数据得到了人类癌症细胞系和人类血液恶性肿瘤原始样本研究结果的进一步支持，结果显示衰老相关的干细胞是一种意料之外的细胞自发性特征，在逃离细胞周期时发挥其有害的，高度积极的生长能力，并且在复发肿瘤中富集。这些发现对于癌症治疗具有深远的意义，并为癌细胞的理解提供了新的观点。 |
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