|
发表期刊 ：Nature communication 影响因子 ：12.353 合作单位：中国农业大学生命科学研究中心 又一位基迪奥客户在《Nature Communication》发表文章，该文章对小鼠骨骼肌再生机制进行深入研究，逻辑清晰，从表型到机制层级递进进行了十分详细的阐述，对我们进行机制研究是个非常好的参考。 除了思路可以参考之外，如果大家做完转录组后不知道该如何验证，那么这篇文章也可以作为一个很好的案例。文章中包含了非常多的验证方法，任何一种都是非常经典的验证手段，可以说是个非常值得借鉴的好文章。基迪奥生物为该项目提供了建库、测序和生物信息服务，通过高质量的专业服务助力合作客户实现持续的高分文章产出，想发高分文章的朋友们可以与我们联系哦。
前言 为了帮助大家深入了解这篇文章，我们提前先将一些关键点列出来，这样我们能更好的理解作者文章的逻辑和思路。 背景：卫星细胞（SCs）对骨骼肌再生至关重要，但其调控卫星细胞的分子机制尚不完全清楚，因此本文的研究围绕着卫星细胞的调控机制展开。 Pax7/MyoD/Myf5：Pax7、MyoD和 Myf5都是在卫星细胞中表达的标志性基因，对骨骼肌的再生、维稳都起到了重要作用。在文章中，作者多次通过观测这些标志基因的表达情况，判断肌肉细胞的变化。 Islr：富含亮氨酸重复序列(Islr)的免疫球蛋白超家族是本文研究的核心，它能稳定典型的Wnt信号，促进骨骼肌再生。在缺乏Islr的情况下，成肌细胞由于分化缺陷而不能发育成成熟的肌管，从而延缓成年小鼠骨骼肌的再生。 C2C12： C2C12成肌细胞是在创伤后重建肌肉组织的前体细胞，具有很好的分化能力，在本文中，C2C12成肌细胞被用来在体外系统研究肌肉的发育和分化。
文章概要 当肌纤维受损后，肌卫星细胞可以进行增殖分化，参与肌纤维的修复，但其调控卫星细胞的分子机制还不清楚。作者从组织学分析、免疫组化、Western blot实验、转录组测序等多种方法全面的进行了研究，从而发现Islr是骨骼肌再生的重要调节因子。
实验方法 对照组C2C12细胞和处理组shIslr（利用shRNA敲除Islr）的 C2C12细胞。在生长培养基(G2)中培养2d或分化培养基(D3)中培养3d后，对这两组细胞进行RNA-seq测序。 研究思路 常见的机制研究的思路是从表型→组织→细胞→分子机制（关键通路、目标分子），作者通过发现Islr参与骨骼肌再生，推测Islr可能在其中起到作用，最终通过一系列不同水平不同角度的实验最终验证了猜想，获得了最终的结果。 图1.研究思路和骨骼肌再生过程中Islr作用的模型 研究结果
1 Islr在分化的肌原细胞中高度表达 研究的第一步，就是先找一个研究的对象，而在本文中，作者首先需要确认Islr是否有参与骨骼肌再生过程，因此作者通过多种方法进行验证： 小鼠胫骨前肌（TA）注射心脏毒素(CTX)后，观测Islr的表达水平；对TA肌肉进行Islr、Pax7、MyoG的免疫组化染色，分析Islr在肌细胞生成过程中的表达（图2）；从野生型小鼠中分离出SCs，与活化SCs比较Islr的 mRNA和蛋白的表达水平；构建Islr表达载体，在体外定位C2C12细胞中Islr的表达。通过一系列的实验表明，发现Islr在分化的肌原细胞中有高表达，暗示Islr可能在骨骼肌再生过程中起到作用。 图2.Islr在卫星细胞分化和C2C12分化过程中上调
2 Islr的缺失延迟了成年骨骼肌的再生 确定了Islr参与骨骼肌再生过程之后，我们通常会将基因进行敲除或者过表达，研究缺失或过表达该基因后会对表型产生什么影响，因此作者第二步就是研究当Islr缺失时，会对骨骼肌的再生产生哪些影响。作者通过条件性基因敲除实验将细胞中Islr敲除，比较对照(Ctrl)和Islr缺失小鼠（cKO）在正常和注射心脏毒素(CTX)后Islr的情况。 通过对损伤后3.5 d、5 d和14 d的TA肌肉进行组织学分析，Islr 缺失小鼠的肌纤维直径、细胞核、肌纤维平均横截面积(CSA)等指标都要远远低于对照组小鼠（图3）。这些结果表明，Islr的缺失延缓了成年骨骼肌的再生。 图3. 损伤后第5天肌肉纤维数目（左）和肌纤维平均横截面积(CSA)（右）
3 Islr调控SCs的分化潜能 在组织水平研究了Islr的作用后，接下来通常会在下一级的细胞水平进行验证。由于Islr在分化的肌原细胞中的高表达，而卫星细胞（SCs）对骨骼肌再生又至关重要，因此作者研究Islr在SCs分化过程中的起到什么作用。通过对损伤后Islr缺失小鼠与对照组比较，发现eMyHC+（新生肌纤维标志物）含量明显减少、MyoG+细胞显著减少、MyoG和eMyHC蛋白水平显著降低（图4），以上结果说明SCs的分化潜能降低，表明Islr具有调控SCs的分化潜能的作用。 图4.损伤后Islr缺失小鼠与对照组比较
4 Islr通过dvl2介导的Wnt信号通路起作用 在组织和细胞水平都进行了验证之后，就可以进行分子水平机制研究，最常用的方法就是采用高通量测序的方法，对样本中全部的RNA分子一网打尽，再从中筛选关键通路和目标分子。因此为了进一步研究Islr在分化过程中的分子机制，作者将对照组C2C12细胞和处理组shIslr（利用shRNA敲除Islr）的 C2C12细胞，分别在生长培养基(G2)或分化培养基(D3)中培养，对这两组细胞进行RNA-seq测序。 结果显示在G2和D3中均有19个信号通路表达被调控，由于C2C12细胞的分化主要受到Wnt信号的调控，Wnt信号可以直接调控MyoD和MyoG的表达，因此作者重点研究Wnt信号通路。shIslr C2C12细胞中Wnt通路受体和下游靶基因、与肌原发育相关的基因的表达显著下调，并且通过QPCR进行了验证（图5）。这些结果表明，shIslr C2C12细胞中Wnt信号通路的受到明显干扰，导致了分化缺陷。 在确定了关键通路之后，就可以进一步从中筛选目标基因。Dvl2是Wnt信号转导中重要组成部分，Western blot显示敲除Islr的C2C12细胞在增殖和分化过程中，Dvl2的蛋白水平表达明显下降。作者还发现在Islr 缺失小鼠的原代成肌细胞分化过程中，Dvl2蛋白水平显著降低。说明Islr可能通过Dvl2介导的Wnt信号通路来调控C2C12细胞分化。 常规的研究通常到了上一步就结果了，但是有时候我们想将论点更加完善时，还可以做些其他角度的验证。前面都是从细胞水平（体外实验）进行验证，为了进一步证明Islr 会通过Dvl2影响小鼠的骨骼肌再生，作者又从检测了小鼠肌肉损伤后3d时Dvl2的表达情况（体内实验），发现其表达模式与Islr一致，在损伤后5d，Dvl2和Islr都高表达。 除此之外，先前有报道表明抑制Dact1可上调Dvl2的表达，从而激活Wnt信号通路。因此，作者又构建了Islr/Dact1双突变小鼠，发现在这个双突变小鼠中 Dvl2的表达水平被恢复，Wnt信号被重新激活。通过一系列的体内和体外实验，获得了明确了Islr可以通过调节Dvl2来调控Wnt信号。 图5. 处理组和对照组在G2和D3培养基中的关键差异基因热图
5 Islr通过拮抗自噬系统稳定Dvl2 虽然做到上一步，已经有非常完整的结论了，而作者又在上述的基础上做了更深入的研究（小小的感叹一下，有这么完善的研究，何愁发不了NC呢）。有研究表明，自噬系统会通过调节Dvl2的表达水平来调节Wnt信号，因此作者使用质粒检测C2C12细胞自噬的发生。结果显示过表达Dvl2会增加质粒的形成，然而Islr和Dvl2的共过表达会降低质粒的形成，表明Islr会与Dvl2共表达从而拮抗自噬系统（图6）。 为了确认Islr是否与Dvl2相互作用拮抗自噬系统，作者还进行免疫沉淀分析，发现Islr与Dvl2相互作用。同时，也发现Islr在分化的原代成肌细胞中与Dvl2相互作用。在多方面的验证下，作者得结论，Islr通过拮抗自噬系统稳定Dvl2蛋白。 图6. 免疫荧光检测过表达Dvl2、Islr、共过表达Dvl2与Islr的C2C12细胞的自噬情况
小结 作者首先发现Islr参与骨骼肌再生，接着从组织水平发现Islr的缺失会延缓小鼠骨骼肌的再生，接下来在细胞水平发现Islr会调控SCs的分化潜能。为了深入了解Islr在其中的分子机制，作者通过转录组测序，进一步发现Islr保护Dvl2免受自噬介导的降解，从而激活了Wnt信号通路。 从组织到细胞再到通路，最终达到目标分子，作者通过抽丝剥茧的方式，一层一层的将Islr参与骨骼肌再生的机制完整的展示出来，是一个非常值得借鉴的文章思路哦。 |
|
|
