细胞“胞葬”新表型 常规套路=Nature

胞葬，死亡细胞的真正归属。

 

老话说，入土为安，落叶归根，那么凋亡细胞的归属又在哪里呢？答案就是吞噬细胞。正常生理情况下，吞噬细胞可对细胞凋亡小体进行及时的吞噬清理，以此来扑灭炎症之火，还机体一片安宁。

此过程被研究者形象地称之为“细胞埋葬”，简称“胞葬”（Efferocytosis）。一旦机体内的胞葬作用减弱或缺陷，就会导致各种疾病的产生，如自身免疫性疾病、动脉粥样硬化等等。

那么吞噬细胞胞葬作用是如何维持机体的稳态呢？Morioka等发现溶质载体家族SLC在其中发挥重要作用，文章发表在2018年11月的《Nature》上，荷叶今天和大家分享下他们的研究套路和研究结果。（回复“181210”，可下载文献）

筛选差异表达基因

为了了解吞噬细胞的胞葬作用，Morioka等选择仓鼠LR73吞噬细胞吞噬凋亡的人Jurkat细胞作为研究模型，选择人Jurkat细胞是为了便于区分凋亡细胞的RNA与仓鼠RNA，然后经过RNA-Seq分析LR73吞噬细胞在胞葬过程中转录谱的变化。

图1 RNA-seq筛选胞葬过程中差异表达基因实验流程

生物信息学分析发现溶质转运SLC家族许多成员基因表达发生变化，33个SLC有差异表达，19个上调，14个下调。

对33个SLC进行功能分析，发现主要分为两大类：与碳水化合物代谢相关的SLC表达上调，而与氧化磷酸化、脂肪酸氧化相关的SLC表达下调。

图2 LR73胞葬过程中转录谱变化的生物信息学分析

验证差异表达基因

作者重点关注SLC家族的变化，通过体内、体外实验验证RNA-seq的结果。

体外实验：培养小鼠的腹腔巨噬细胞，胞葬凋亡Jurkat细胞后实时定量PCR检测SLC的变化。

体内实验：将凋亡Jurkat注射入小鼠腹腔，2小时后分选CD11b+F4/80+巨噬细胞，实时定量PCR检测分选巨噬细胞SLC的变化。

图3 小鼠腹腔巨噬细细胞胞葬凋亡Jurkat细胞后相关SLC的变化

候选基因功能研究

作者选择SLC2A1和SLC16A1作为主要的靶分子（荷叶猜测其原因可能是SLC2A1是人们所熟知的GLUT1，是葡萄糖的重要转运蛋白，而SLC16A1又称为MCT1，是乳酸、丙酮酸运输出细胞的重要蛋白，它们都是热点研究分子）。

作者首先从5个方面在体外研究了SLC2A1对胞葬的作用：1）过表达SLC2A1促进胞葬，2）SLC2A1的抑制剂STF-31抑制胞葬，3）SLC2A1干扰削弱胞葬，这种干扰作用被该SiRNA抵抗的SLC2A1所挽救，4）Crisp-Cas9敲除LR73的SLC2A1降低胞葬，5）在SLC2A1敲除小鼠中分离培养的骨髓来源BMDM中观察到胞葬减弱。

图4 体外实验证明SLC2A1促进吞噬细胞胞葬

进一步，作者在体内研究了SLC2A1对胞葬的作用。SLC2A1抑制剂STF-31在体内能抑制腹腔巨噬细胞对凋亡Jurkat细胞的胞葬；此外在地塞米松诱导的胸腺细胞凋亡模型中，SLC2A1抑制剂STF-31能促进凋亡细胞向细胞坏死进展，间接说明STF-31削弱吞噬细胞的胞葬作用。

图5 SLC2A1抑制剂在体内抑制吞噬细胞的胞葬

在斑马鱼的模型中观察到，SLC2A1的反义寡核苷酸能使巨噬细胞胞葬作用的减弱；此外作者还利用了小鼠的动脉粥样硬化模型，在巨噬细胞中敲除SLC2A1基因促进动脉粥样硬化的进展，粥样斑块内部晚期凋亡细胞（TUNEL+）明显增多。

图6 敲低或敲除SLC2A1抑制巨噬细胞的胞葬

SLC2A1是葡萄糖的转运蛋白，而且转录谱研究提示胞葬过程中糖酵解增强，氧化磷酸化作用减弱，因此作者研究了糖代谢与胞葬的关系。

研究发现许多糖酵解代谢相关酶在胞葬过程中表达上调，如SLC2A1的磷酸化酶SGK、糖酵解关键酶己糖激酶HK、PFKFB3、糖酵解相关转录因子HIF1α等等，Seahorse胞外产酸实验和氧耗率实验结果证实胞葬过程中吞噬细胞糖酵解增强，氧化磷酸化作用减弱。

图7 胞葬过程中糖酵解相关酶表达上调，糖酵解增强，氧化磷酸化减弱

另一候选基因是SLC16A1，它能使糖酵解产生的乳酸运出细胞，这样能使糖酵解代谢通路持续运转下去。研究发现，敲低SLC16A1的表达导致胞葬过程中胞外乳酸含量减少，而吞噬细胞内乳酸含量升高。

图8 敲低SLC16A1在胞葬过程中对乳酸的影响

此外，巨噬细胞胞葬后排出细胞外的乳酸能对周围巨噬细胞产生影响，促进周围巨噬细胞向M2抗炎反应方向极化，促进TGFβ，IL10，VEGF等抗炎促修复因子的表达，而敲低SLC16A1后这种效应消失。

图9 SLC16A1促进抗炎微环境的产生

提出理论假说

凋亡细胞分泌的小分子，如ATP等能诱导AGK1表达上调，该蛋白促进SLC2A1发生磷酸化激活，促进葡萄糖转运如细胞。

在凋亡细胞与吞噬细胞接触过程中磷脂酰丝氨酸诱导SLC2A1表达升高促进葡萄糖转运如细胞，促进糖酵解。

在凋亡细胞内吞过程中，SLC16A1表达上调，它能促进糖酵解产生的乳酸排除细胞外，作用于微环境其他吞噬细胞，分泌抗炎因子，组成抗炎微环境。

图10 胞葬不同阶段对SLC2A1，SGK1和SLC16A1表达的影响

图11 SGK1-SLC2A1-SLC16A1调控胞葬作用示意图

荷叶感悟

让我们再回顾一下该文献，其实该文献的研究套路与常规研究套路基本上是一样的，筛选差异基因、挑选候选基因做验证、候选基因功能研究等，不过荷叶认为至少以下几点值得大家学习：

1）生物信息分析结果的展示简洁、明了，即使外行看了都明白是怎么回事。

2）在差异基因中挑选中下功夫，首先是如何聚焦到SLC家族，SLC家族中又如何聚焦到2个基因的，荷叶觉得结合研究的热点挑选候选基因可能有一定的优势。

3）多角度、多层次检测差异基因的功能，如本文中用到了体内、体外、敲低、敲除、抑制剂、过表达、细胞模型、疾病模型、转基因斑马鱼、转基因小鼠等实验，实验种类真不少，文章水平大大提高。

参考文献：

Morioka S, et al. Efferocytosis induces a novel SLC program to promote glucose uptake and lactate release. Nature. 2018 Nov;563(7733):714-718.