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这大概又是别人家的microRNA吧！ 近年来，随着高通量测序技术的飞速发展，火了十几年的microRNA似乎已经过气，取而代之的是各种small RNA、lncRNA、circle RNA及mRNA等，但是否就真的没必要研究microRNA了呢？ 其实不然，以“microRNA”为关键词进行文献检索，就会发现一两分的文献确实非常多，但3分以上的也不是没有，今天我们就来看看这篇文章是如何利用microRNA发3分的吧。 1 文章背景 基于视网膜中表达的一些microRNA与视网膜细胞凋亡密切相关，作者们的前期研究已经证实了miR187在视网膜细胞凋亡中起着重要的作用，具体表现在降低miR187水平可诱导视网膜神经节细胞（RGCs）凋亡。 然而青光眼是由病理性高眼压引起的复杂神经退行性疾病，RGCs的氧化应激是青光眼视神经损伤和神经退行性变的重要因素。P2X7受体(P2X7R)是配体门控的离子通道，广泛表达于视网膜细胞中，P2X7R通过上调细胞内Ca2+而诱导青光眼RGCs凋亡。 因此，本研究试图探讨P2X7R诱导青光眼RGCs凋亡的机制是否与氧化应激有关。 另外，生物信息学分析显示miR187与P2X7R 3’-UTR通过直接结合而发生潜在的相互作用。鉴于miR187和P2X7R在青光眼中的关键作用，因此作者假设miR187通过与P2X7R相互作用而正向调节视网膜细胞的存活。 2 文章解析 为了探讨提出的问题以及验证假设，作者们做了下面的实验。 首先在体外建立一个RGCs凋亡的模型：将小鼠神经节细胞（RGC-5）置于高压(0、15、30、100mmHg)下24小时，观察到与正常气压中培养的细胞相比，在30和100mmHg高压下细胞存活率显著降低(图1A)。 此外，浓度为25μM或更高的谷氨酸（Glu）预处理48小时也可显著抑制RGC-5细胞的存活率（图1A）。同时，升高压力（30和100mmHg）和Glu处理（25、50和100μM）均可诱导RGC-5细胞凋亡（图1B）。 其次，为探讨高压和谷氨酸是否可引起视网膜细胞氧化应激损伤，采用H2O2暴露诱导氧化损伤，作为高压和谷氨酸阳性对照。 与对照组相比，高压（100mmHg）、谷氨酸（100M）和H2O2（400M）增加了RGC-5细胞的细胞内ROS水平（图2A）。同时，RGC-5细胞中的另一个重要的氧化应激生物标志物（MDA）也因压力、谷氨酸和H2O2的升高而显著升高（图2B）。 然而，用抗氧化剂NAC(5mM，1h)预处理RGC-5细胞，可显著抑制由压力、谷氨酸和H2O2升高引起的细胞内ROS和MDA水平的升高(图2A和2B)。此外，qRT-PCR表明，在RGC-5细胞中，miR187受到升高的压力、谷氨酸和H2O2的显著下调（图2C）。 相比之下，高压、谷氨酸和H2O2处理的RGC-5细胞与对照RGC-5细胞相比显示高水平的P2X7R mRNA和蛋白质(图2D)。结果表明，RGC-5细胞在压力、谷氨酸和H2O2诱导的氧化应激作用下，miR187表达降低，P2X7R表达增加。 接下来，为了探讨miR187在氧化应激中的作用，通过转染miR187 mimics，在RGC-5细胞中过表达miR187。如图3A所示，miR187过表达显著抑制了由压力、谷氨酸和H2O2升高引起的细胞内ROS和MDA水平的升高（图3B）。这些结果表明miR187过表达阻断RGC-5细胞压力升高、谷氨酸和H2O2诱导的氧化应激。 进一步研究miR187对高血压、谷氨酸和过氧化氢诱导的RGC-5细胞凋亡的影响。结果表明，下调的miR187至少部分地介导了高压、谷氨酸和H2O2诱导体外培养的RGC-5细胞凋亡。 然后通过构建含有野生型或突变型P2X7R 3’UTR的重组荧光素酶报告质粒来探究miR187与P2X7R的相互关系。miR187过表达显著抑制了RGC-5细胞中P2X7R mRNA和蛋白的表达(图5C)。 P2X7R mRNA和蛋白表达在miR187抑制的RGC-5细胞中显著上调(图5D)。这些结果表明，miR-187可能通过与P2X7R的3’UTR相互作用，负调控RGC-5细胞中P2X7R的表达。 之后为了确定miR187是否通过P2X7R参与氧化应激诱导的RGC-5细胞凋亡，miR187 mimics与pcDNA-P2X7R共转染。通过结果证实miR187通过负性调节P2X7R抑制氧化应激诱导的RGC-5细胞凋亡。 最后进一步阐明了miR187在慢性高眼压大鼠视网膜细胞凋亡的氧化应激损伤中的作用。 在慢性高眼压大鼠视网膜中，miR187过表达伴随着P2X7R蛋白的显著下调（图7B）。此外，高表达的视网膜MDA通过miR187过表达而减少（图7C）。 3 文章总结 1. microRNA还是值得研究的。像该篇文章这种，事先已经证实了miR187在视网膜细胞凋亡中起着重要的作用：减少miR187诱导视网膜神经节细胞（RGCs）凋亡。按照常规，通过转录组测序筛选出这个miR187并简单地高低表达验证，便可以发一篇两分以上的文章。再根据之前的结果，进一步探究相关联的蛋白，又是一篇文章。 2. 找到相互关联的分子是研究的入手点。我们会发现该文章的思路非常清晰，既然减少miR187 和P2X7R都能诱导青光眼RGCS凋亡，那么miR187与P2X7R是通过怎样的相互作影响视网膜细胞的存活的呢？当然要找这些关联分子自然少不了阅读大量文献，但这样的套路绝对是可以用得上的。
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