 /// 文章简介
研究背景  可变剪接提供了一种对神经元特异基因表达十分重要的机制。一些在神经元细胞中广泛表达的RNA结合蛋白与控制发育调控且神经元特异的可变剪接程序有关，单一蛋白能够调控许多靶标转录本。然而，一些RNA结合蛋白都是在神经元集群中选择性表达，增加了其可能控制细胞类型特异和突触特异的功能的可能性。KH结构域RNA结合蛋白SLM2就是这样一个在小鼠海马体的谷氨酸能锥体细胞和一些特定的释放γ-氨基丁酸（GABA）的中间神经元中高表达的RBP。 研究内容  SLM2对小鼠海马体中的谷氨酸能突触的功能特性至关重要。基因组范围内的比对揭示具有明显选择性的SLM2依赖的剪接程序主要由少量编码突触蛋白的靶标mRNA组成。在Slm2敲除的小鼠海马体中杂合缺失Nrxn1的21号外显子能够恢复突触表型，挽回突触可塑性和行为缺陷。因此，SLM2对单一可变外显子的调控对谷氨酸能突触的功能和可塑性的规范及小鼠行为具有重要作用。 研究方法  首先通过免疫组化和western blot对野生型和Slm2敲除小鼠的海马体组织进行突触结构和组分分析，再通过电生理学实验检测突触的谷氨酸能传导和可塑性。通过对两种小鼠的海马体组织进行RNA-seq获得了转录组数据，经可变剪接分析得到了受SLM2调控的基因及可变剪接事件。推测SLM2调控的Nrxn1的21号外显子可变剪接与该轴突蛋白和配体的互作有关，并通过免疫共沉淀初步证实。进一步假设Slm2敲除小鼠中丧失与这些轴突蛋白配体的跨突触互作，可能导致突触后谷氨酸受体缺陷，通过在Slm2敲除小鼠中杂合去除一个Nrxn1Δex21等位基因，进一步证实该推论。 研究结果  （1） Slm2敲除小鼠中的突触结构和突触组成。在Slm2敲除的小鼠中，能在海马体CA1神经元的初级顶树突上形成正常数量的谷氨酸能棘突触（图1A和B）。WB分析来自野生型和Slm2敲除小鼠海马体的突触体组分，发现其表现出整体正常的谷氨酸能突触蛋白浓度。然而，AMPA型谷氨酸受体（AMPAR）亚基GluA1增多，尤其是在来自成熟的Slm2敲除小鼠突触体的洗涤剂可溶组分中（图1和D）。在来自未成年小鼠的急性切片中，GluA1数量在全细胞裂解液和细胞表面组分中都升高，而N-甲基-D-天冬氨酸受体GluN1亚基的表达没有变化（图1 E和F）。  图1. （2） SLM2是正常谷氨酸能传导和可塑性所必需的。野生型与Slm2敲除小鼠海马体的CA1神经元切片中微小兴奋性突触后电流（mEPSC）振幅和频率没有差别（图2A和B），但后者中mEPSC事件的上升速度和衰减时间表现出微小的增加（图2C和D）。在Slm2敲除的小鼠中，AMPA受体和NMDA受体介导的兴奋性突触后电流比率（AMPAR/NMDAR）显著升高（图2E和F）。与野生型相比，在Slm2敲除的CA1神经元中，刺激谢弗侧支引起了更大的突触后反应（图2G），而双脉冲易化正常（图2H）。证实Slm2敲除小鼠CA1神经元中突触后AMPA受体表面表达及功能的提升。  图2. （3) SLM2依赖的可变剪接程序的基因组范围比对。在全基因组范围内对SLM2依赖的可变剪接事件进行比对，发现不同基因型之间转录本的表达高度相关，表明SLM2不在调控整体的转录本水平中发挥主要功能（图3A）。野生型和Slm2敲除的小鼠海马体中绝大多数外显子基本保持不变（图3B），但有四个基因的可变外显子在敲除小鼠中表现出了不同程度的异常调控。编码突触细胞表面受体的三个轴突蛋白基因（Nrxn1，2和3）的可变剪接片段4（AS4）中的外显子水平增加了2倍以上，而囊泡融合机制的一个组分tomosyn-2（Stxbp5l）的24号外显子水平提高了1.58倍。另外7个外显子尽管变化倍数不高，仍然表现出显著变化（P<>  图3. (4) 在Slm2敲除的海马体中Nrxn1的21号外显子杂合缺失恢复了突触表型。发生在Nrxn AS4上的可变剪接，调控突触前末梢轴突蛋白的选择性跨突触互作。实验发现21个受其调控的候选互作蛋白，六个显著差异蛋白中包括神经连接蛋白，Chadl，LRRTMs和补体C3（图4B）。 假设Slm2敲除的小鼠海马体中Nrxn的可变剪接可能会扰乱其与这些剪接插入敏感配体之间的互作。对其进行免疫共沉淀分析，在野生型小鼠的沉淀中发现大量神经连接蛋白1（NL1）和3（NL3），它们都在Slm2敲除小鼠的沉淀中减少（图4C），而补体C3的共沉淀则轻微上升，证实SLM2的丧失确实转换了突触受体-配体互作关系。在Slm2敲除小鼠中丧失与这些轴突蛋白配体的跨突触互作，可能导致突触后谷氨酸受体缺陷。为了验证这一假设，在Slm2敲除小鼠中杂合去除一个Nrxn1Δex21等位基因，恢复了正常Nrxn1 AS4(-)转录本水平（图4D），从而挽救了內源轴突蛋白与NL1和NL3的跨突触细胞表面互作（图4E），并使急性海马体切片中GluA1量正常化（图4F），部分恢复了短阵快速脉冲诱导的谢弗侧支LTP（图4G），且挽救了小鼠的行为变化（图4H和I）。因此，SLM2对单一可变外显子的调控对谷氨酸能突触功能的特化，可塑性，和小鼠行为具有重要贡献。  图4. 与其他RNA结合蛋白相比，SLM2表现出高度选择性的神经细胞类型特异的表达，且仅有一小部分可变的外显子特异的依赖其功能。基因拯救实验证实单一可变外显子的恢复对SLM2敲除小鼠的表型具有重要影响。猜测这里报道的针对SLM2-轴突蛋白系统的表面受体识别系统的定向，细胞类型特异性的剪接调控，代表了神经回路中一种调控突触特化的通用机制。 Reference  Traunmüller, L., A. M. Gomez, T. M. Nguyen and P. Scheiffele (2016). 'Control of neuronal synapse specification by a highly dedicated alternative splicing program.' Science 352(6288). |
|
|
