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文献简介 慢传输型便秘患者的肠道菌群在调节胃肠蠕动中的潜在作用 Potential role of fecal microbiota from patients with slow transit constipation in the regulation of gastrointestinal motility 期刊名称：scientific reports 时间：2017 年3 月 27日 IF: 4.122 一、摘要 肠道微生物涉及到多项生理功能，它的失调会引起肠道功能障碍。但是菌群是否参与了便秘的发病机制还未可知。本研究提取和分析了采用菌群移植（HMT）进行有效治疗的便秘患者以及移植了该类患者肠道菌群的无菌小鼠，并测量该小鼠的肠道蠕动情况。这些小鼠表现出排便频率和粪便含水率降低，粪便变小，肠胃蠕动时间延迟，结肠平滑肌自主收缩变弱。为了研究肠道蠕动延迟的机制，本研究测量了微生物代谢产物，发现小鼠的短链脂肪酸和次级胆汁酸减少了。此外，便秘患者的肠道菌群发生了改变，其OTUs数量、物种丰富度和α-多样性均大于健康人。这些发现说明在便秘发展过程中，肠道菌群的变化改变了肠道微生物代谢物，进而改变了肠道运动，让失调的肠道菌群恢复平衡可能改善便秘的临床表型。本研究表明调节肠道微生态或许可以成为治疗便秘的新策略。 二、研究背景 慢性便秘是一种功能性肠病，它在世界范围奶有较高的发病率，影响了14%的成年人和将近36%的老年人。根据罗马IV标准，慢性便秘的主要特征为排便困难、排便频率低、排便不完全。慢性便秘可以分成三大类：正常传输型便秘、慢传输型便秘（STC）和排便障碍。这之中，数STC为最具代表性的类别，它会显著增加结肠传输时间（colonic transit time）。 慢性便秘是一种多因素疾病，具有复杂的发病机制，还需要深入研究。先前的研究主要集中在肠道神经系统（ENS）和Cajal间质细胞（ICC），这两者都在结直肠运动性疾病的发病机制中起到重要作用。此外，在肠道运动中扮演中重要角色的结肠内分泌细胞，它在STC患者中的吸收和分泌也发生了变化。还有其他的研究报道STC患者自主功能障碍发生改变、肠系膜和粘膜下神经丛的形态学发生改变和神经递质水平降低等。这些STC研究都只能解释一些病例，且较少关注肠道收缩本身，因而有必要针对便秘的肠道收缩性进行研究。 近来，越来越多的研究表明肠道微生物对人体健康起到重要作用，它们能影响各种人体活动，包括肠道运动。越来越多证据证明，便秘患者的肠道菌群组成与健康人之间存在差异，比如便秘患者拟杆菌属更加丰富。根据布里斯托粪便分类，STC的粪便1,2型，而在Vandaputte的研究中，粪便形状与已知的主要微生物组标记物有关，在这一研究中微生物组标记物与物种的丰富度、Akkermansia和Methanobrevibacter的丰度呈负相关，而与Bacteroidetes-Firmicutes比值（BF比值）呈正相关。另外硬度大的粪便其体内产甲烷菌如Methanobrevibacter的丰度较高，这与另一项研究的发现一致：慢性便秘患者甲烷产量增加，而甲烷被认为减缓了肠道的蠕动。便秘患者这些病理生理学改变引出了一个反响，肠道菌群的改变是否是便秘的原因之一？另一方面，HMT也被认为是一项治疗胃肠功能紊乱的技术手段，它通过恢复肠道微生态来起到治疗效果。事实证明HMT是一项安全有效的治疗手段，在治疗慢性便秘方面，研究团队所在医院的临床改善率和缓解率达到66.7%和42.9%。但是，这些肠道菌群和肠道运动相关性的研究中，没有提到肠道菌群的显著变化是否是便秘的原因。 关于肠道菌群代谢物的作用已有很好的文献记载。其中重要的两项是短链脂肪酸链（SCFAs）和胆汁酸（BAs）。SCFAs在大鼠中被证明通过神经和多肽YY的释放来改变结肠运动，它也能刺激位于迷走神经感觉纤维的5-HT3受体，使肠嗜铬细胞（ECs）释放5-HT，从而改变结肠运动。BAs则是通过激活TGR5，来刺激ECs和初级传入神经元释放5-HT和降钙基因相关肽，来引起蠕动反射。而次级胆汁酸（SBAs）被认为能直接作用于ECs，提高TPH1的表达，使其合成5-HT。5-HT可诱导结肠平滑肌收缩。 为了回答肠道菌群的显著变化是否是便秘的原因，本研究选择了6个经过HMT治疗有效的STC患者，将这些患者的肠道菌群移植到小鼠肠道并监测小鼠的便秘症状，本研究还检测了小鼠的SCFAs和BAs，来说明STC的肠道菌群在肠道运动中的可能机制。 三、研究方法 收集用于肠道菌群移植（HMT）的健康人、STC患者的粪便，进行16S测序。经过HMT治疗有效的STC患者的粪便用于后面的动物实验。 挑选80只6-7周大的C57BL/6小鼠，在前4周喂食含有广谱抗生素的水，抗生素每两天换一种，4周之后收集粪便样本，冻存在-80°C环境下。在无菌环境下，取1g健康供体和STC供体的新鲜粪便，加入10ml reduced PBS进行稀释，经过离心后，取0.2ml悬浊液填喂给每只小鼠。每周填喂一次，持续8周。定植结束后，部分来自同一供体的小鼠接着喂食含有SCFAs（1.1% 丁酸钠）或次级BAs（0.5% 脱氧胆酸钠）的水两周，每两天更换一次水，实验设计如图1。 图1. 实验设计方案 总肠胃运动时间的检测，经过一夜可以饮水的禁食后，给小鼠填喂0.1ml含有伊文思蓝（5%）与甲基纤维素（1.5%）的半流体溶液，接着，在首次出现蓝色粪便后每隔10分钟监测一次粪便。结肠运动的检测采用排珠试验，将3mm的玻璃珠通过肛门插入结肠，然后测量玻璃珠的排出时间。粪便理化参数的测量，观察自由进食的小鼠24小时，每隔2小时统计一次粪便数量，然后通过比较干燥前和干燥后（60°C下干燥24小时）的重量来测量粪便含水量，最后测量了每只小鼠的粪便大小。 测量完粪便参数，取小鼠的完整肠道用于平滑肌收缩的分析，近端结肠的纵向肌肉放置在含有测力传感器的37°C器官浴槽上，在测力前将静息张力设置在0.5g左右，记录纵向肌肉等张收缩1小时的结果，在实验后测量30分钟基础张力的平均振幅和阶段性收缩的频率。 盲肠中短链脂肪酸和胆汁酸的测定，将盲肠的内容物冻干，制成粉末，然后利用气相色谱-质谱分析法测定SCAFs（乙酸、丙酸和丁酸），BAs则使用液相色谱-质谱分析法测定。 人与小鼠的微生物分析采用16S测序方法，扩增区域为v4区，测序平台为MiSeq，测序策略为PE250，分析工具选择了MOTHUR和QIIME。 四、研究结果 供体的特征和菌群移植（HMT）提高STC疗效 共有6个STC患者和3个健康供人入研究，6个患者均接受过HMT治疗，年龄在48-65岁之间，平均57.2岁，症状持续时间在6-20年之间，平均13.7年。分析结果显示，便秘患者的OTUs数量多于健康人，物种丰富度（Chao）和α-多样性指数（Shannon）也都大于健康人。两组之间的菌群结构有差异，如图1所示。经过HMT后，排便次数从每周1.6 ± 0.2 增加到5.0 ± 0.4，粪便硬度也从2.0 ± 0.3 改善为 3.3 ± 0.2。此外，移植完12周之后，患者便秘症状评估问卷结果和胃肠道生活质量指数显示，便秘情况有了改善。对比治疗之前，结肠传输时间从81.9 ± 9.5 t缩短到53.3 ± 11.2小时。 图2. 健康供体和STC供体的肠道微生物组成。H为健康供体，S为STC供体，A为门水平，B为纲水平，C为目水平，D为科水平，E为属水平，F为种水平 表1. 菌群移植（HMT）的效果 BM：排便次数；PAC-SYM：患者便秘症状评估等分；GIQLI：胃肠道生活质量指数；CTT：结肠传输时间 模拟无菌小鼠的肠道微生物组成 通过喂食小鼠4周的广谱抗生素来模拟无菌小鼠。经过抗生素处理之后，小鼠的肠道菌群发生了很大变化，如图3所示。OTUs数量显著降低，大部分肠道微生物的丰度下降。物种丰富度和α-多样性均有所变化。因为大部分的肠道微生物都被消失了，因此在无菌设备有限的条件下，这样的模拟无菌小鼠可以应用于人源化研究。
来自STC供体的肠道菌群影响模拟无菌小鼠的粪便性状、总胃肠传输和结肠传输 经过8周，填喂STCheck健康供体粪便的小鼠，各项粪便指标与肠道运动均受到影响，与填喂健康供体的小鼠相比，填喂STC的小鼠排便频率更低，含水率更低，粪便更小，但两类小鼠的体重没有差异，总胃肠传输时间，STC小鼠更长，结肠传输结果也是如此，结果如图4所示，表明STC患者的肠道菌群可引起小鼠的结肠蠕动更慢。这些说明，接受了STC供体的肠道菌群后，小鼠表现出了便秘的典型症状。 图4. 移植了不同的肠道菌群后小鼠的排便频率（A），粪便含水量（B）, 粪便大小（C），体重（D），总胃肠传输时间（E）和结肠传输时间（F）的比较。N指移植了健康供体肠道菌群的小鼠，C指移植了STC供体肠道菌群的小鼠。 近端结肠肌收缩性 STC小鼠的排便减少和肠道运输的迟缓，说明肠道平滑肌自主收缩受到STC供体肠道菌群影响的可能性很大。STC小鼠的结肠纵向平滑肌的自主收缩受到抑制，张力显著降低，但收缩的波形没有显著改变，结果如图5所示，因此表明STC的肠道菌群抑制结肠平滑肌的收缩，最终导致胃肠动力缺乏。 图5. 移植了不同的肠道菌群后小鼠的结肠收缩性对比。A为接受健康供体肠道菌群的小鼠，B为接受STC供体肠道菌群的小鼠。C、D为收缩张力和频率的比较。N为接受健康供体肠道菌的小鼠，C为接受STC供体肠道菌群的小鼠。 小鼠结肠的代谢受到STC供体肠道菌群的影响 结肠中的SCFAs多是由细菌发酵膳食纤维和抗性淀粉而产生。BAs则是内源性分子，肝细胞中的胆固醇形成初级BAs，再由肠道中的微生物代谢成次级BAs，最后再合成BAs。本研究通过分析小鼠盲肠的SCFAS和BAs得到，与接受健康供体的肠道菌群相比，接受STC供体肠道菌群的小鼠，其丁酸含量显著降低，乙酸和丙酸则没有显著性差别，初级BAs也无显著性差别，但是次级BAs的浓度则有降低的趋势，脱氧胆酸（DCA）水平也降低，石胆酸（LCA）也下降显著。因此表明STC的肠道菌群会影响肠道运动可能是因为类似SCFAs和BAs的代谢发生了变化导致的。 图6. 移植了不同的肠道菌群后小鼠结肠处的代谢变化。A-C分别为乙酸、丙酸和丁酸的对比，D-G为初级胆汁酸CA和CDCA，次级胆汁酸DCA和LCA 对比。N为接受健康供体肠道菌的小鼠，C为接受STC供体肠道菌群的小鼠。 补充丁酸盐和次级BSs改变小鼠肠道运动 在小鼠喝的水中添加丁酸盐和DCA 2周后，测量小鼠的排便频率，粪便含水量，粪便大小和结肠收缩性。与接受STC供体肠道菌群但没有补充DCA和丁酸盐的小鼠对比，DCA处理的小鼠粪便含水量提高了，结肠收缩张力有了显著提高，但是排便频率、粪便大小和收缩频率没有改善；丁酸盐处理的小鼠则有更高的排便频率和粪便含水率，肠道收缩张力和频率也增加了，但是粪便大小依然没有太大差别。 图7. DCA和丁酸盐的补充对排便频率（A）、粪便含水量（B）、粪便大小（C）、结肠收缩（D:张力，E：频率）D的影响。 五、讨论 人们逐渐认识到，建立和维持肠道微生物群与人体的有益平衡，是肠道正常运行的必要条件，肠道微生态的失调会引起功能性胃肠疾病的发生，因此研究STC患者肠道微生物在肠道运动中所起作用的重要性不言而喻。本研究通过招募经过菌群移植（HMT）有效治疗的STC患者作为供体，然后将这些供体的肠道菌群通过填喂粪便的方式移植到模拟无菌小鼠身上，这些小鼠相应地出现了STC的症状，SCFAs和BAs的代谢也发生了改变，在补充了丁酸盐和DCA后，小鼠的一些症状有了改善，这可以说明可能是由于肠道微生物群紊乱，改变了宿主的新陈代谢，影响了胃肠运动。因此，本研究认为便秘患者失常的肠道菌群改变了宿主代谢进而影响了肠道运动。 肠道菌群在肠道感受和运动功能的发育和维持上扮演着重要的角色。在无菌小鼠上的研究表明胃排空和胃肠传输时间明显长于传统饲养的小鼠。Bacteroidesthetaiotaomicron被报道通过提高表达γ-aminobutyric、vesicle-associated protein-33和enteric γ-actin来刺激肠运动。Lactobacillus acidophilus 和Bifidobacterium bifidum 会通过释放神经信号来加快肠道运动，而Micrococcus luteus和Escherichia coli则起到抑制的作用。本研究通过STC小鼠上出现便秘症状也说明，便秘患者的肠道菌群发生了改变，目前也有越来越多的研究得到了这样的结论，例如unclassified_Ruminococcaceae、Alistipes、和Oscillibacter与排便频率呈负相关，人肠道微生物可以促进结肠ECs合成5-HT从而调节肠道运动。因此本研究说明正常的肠道微生物可在肠道运动中具有调节作用。 肠道菌群代谢和宿主生理之间的一系列令人信服的关系已经被报道。来源于膳食纤维发酵的SCFAs可以直接抑制组蛋白脱乙酰基酶类、激蛋白偶联受体，并可作为能量底物，可影响生理过程的多个方面。SCFAs被报道能通过肠胆碱能反射来刺激肠道的收缩。SCFAs中的丁酸在微生物依赖-TLR的感受中具有重要调节作用，这与肠道运动有关联。在本研究中，移植了STC菌群的小鼠与移植了健康人菌群的小鼠相比，丁酸水平显著降低，通过补充丁酸盐后，排便频率、粪便含水量和结肠收缩性都有所改善，因此，来自STC供体的肠道菌群可能通过影响SCFAs的产生来调节肠道运动。 另一项重要的微生物代谢物BAs，被证明可以通过激活ECs产生血清素（5-HT），从而改变肠道运动。本研究发现移植了STC菌群的小鼠次级BA的水平降低了，表明BAs的代谢收到干扰。次级BAs的降低，引起了ECs分泌5-HT的降低。进而影响肠道运动。在补充了DCA之后，STC小鼠粪便的含水率、结肠收缩性也都有了改善。不过，人和小鼠之间的BAs微生物代谢不同，人体中的初级BAs是CA和CDCA，而小鼠是CA和MCA。因此，本研究在这方面从小鼠上得到的结论是否能推到人身上需要进一步讨论。 HMT在多种胃肠道功能紊乱治疗上有效果，例如艰难梭菌感染（CDI），炎症性肠病（IBD），肠应激综合征（IBS）。之前的研究认为HMT可以增加肠道运动，改善Wexner便秘得分和STC患者的GIQLI值。有研究报道，复发性CDI患者的BAs代谢发生了紊乱，而HMT可以使肠道菌群结果恢复正常，进而修复这样的代谢异常。在UC上，HMT也有积极的临床反应。因此，HMT可以恢复患者的肠道微生物和异常的微生物代谢。综上，来自STC供体的肠道菌群被证明能影响肠道运动，通过HMT调节肠道微生态或许对治疗便秘效。 总之，本研究的结果认为小鼠中来自便秘患者的肠道菌群可以通过调节宿主的代谢影响肠道运动和粪便性状，恢复便秘患者的肠道微生态或许可能改善症状。 DOI:10.1038/s41598-017-00612-y |
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