单细胞转录组在动物研究中的应用

现在单细胞测序有多火就不用多说了，在各个研究领域都有单细胞忙碌的身影。目前10x Genomics单细胞转录组已发表的文章中，物种绝大多数还是人和小鼠的，今年已有其他物种的文章陆陆续续冒了出来，今天就来盘点一下目前已发表的动物研究领域的10x单细胞转录组文章，包括小鼠、斑马鱼、果蝇、海鞘、蝾螈，看看有没有你的研究领域和方向。还没搭上10x单细胞这趟早班车的抓紧时间啦～

小鼠

文章特别多，列举两篇有代表性的：

小鼠20个组织单细胞图谱

Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris

发表期刊：Nature

影响因子：41.577

发表时间：20181003

材料与方法：来自三个月大的三只雌性小鼠和四只雄性小鼠的20种器官，FACS方法分离出44,949个细胞进行SMART-Seq2，55,656个细胞进行10x Genomics单细胞转录组

研究对来自小鼠20个器官和组织的约10万个单细胞进行测序分析，结果揭示了之前研究中从未在完整展示的基因表达图谱，并且能直接比较不同组织和细胞类型的基因表达，最终建立了一个名为Tabula Muris的储存小鼠细胞细信息的开源数据库。

研究运用了两种单细胞技术：一种方法是基于微流体液滴的10x Genomics单细胞转录组，能够在相对低的覆盖率下检测数千个细胞；另一种是基于FACS分选的单细胞全长转录组分析，能够在高覆盖范围内检测单个细胞。

图1  小鼠细胞t-SNE可视化

 

小鼠小脑发育图谱

A Single-Cell Transcriptional Atlas of the Developing Murine Cerebellum

发表期刊：Current Biology

影响因子：9.251

发表时间：20180924

材料与方法：收集跨越小脑发育的12个时间点小鼠小脑组织--八个胚胎发育阶段（e10，e11，e12，e13，e14，e15，e16和e17）和四个出生后时间点（P0，P4，P7和P10），每个时间点设置两个生物学重复，共得到39245个小鼠小脑细胞10xGenomics单细胞转录组表达谱。

研究得到了来自十二个关键发育时间点的小鼠小脑单细胞图谱，鉴定了主要的小脑细胞亚群，确定了有助于小脑发育的亚群（包括顶板细胞、胶质细胞和脑膜）。利用已知的谱系标记进行验证，表明单细胞数据能准确概括小脑的发育。利用拟时分析，确定了调控谷氨酸能细胞分化命运的关键转录因子。最后，创建了名为Cell Seek的数据集，为未来小脑发育、神经生物学和疾病研究提供宝贵资源。

图2  小鼠小脑取样时间点示意图

斑马鱼

斑马鱼先天性淋巴细胞研究

Single-cell transcriptional analysis reveals ILC-like cells in zebrafish

发表期刊：Science Immunology

影响因子：暂无

发表时间：20181116

材料与方法：将来自Tg(lck:EGFP)rag1−/−突变和野生型斑马鱼的肠道制成单细胞悬浮液，设置三种条件（PBS注射、V. anguillarum注射及Anisakis simplex注射），每种条件三条斑马鱼，共收集12000个lck+细胞进行10x Genomics单细胞转录组测序分析；将来自rag1−/−突变和野生型斑马鱼的肾、肠、鳃、脾和胸腺制成单细胞悬液，约1000个单细胞进行Smart-seq2全长转录组测序分析。

先天性淋巴细胞（ILCs）是哺乳动物免疫应答和体内平衡的重要介质。然而，在其他脊椎动物中ILCs的存在和功能却知之甚少。研究利用单细胞转录组测序获得了组织稳态期间和免疫攻击后斑马鱼淋巴细胞的综合图谱，从野生型斑马鱼的肠道以及rag1突变（缺少T和B细胞）的斑马鱼中共收集14080个单细胞，发现了ILC样细胞。进一步分析发现了一个rorc阳性的ILC亚群，可以表达与1型、2型和3型免疫应答相关的细胞因子。研究还确定了斑马鱼其他新的ILC标记分子。

图3  ILCs细胞异质性图谱

单细胞转录组研究斑马鱼松果体缰神经元

Comprehensive Identification and Spatial Mapping of Habenular Neuronal Types Using Single-Cell RNA-Seq

期刊：Current Biology

影响因子：9.251

发表时间：20180402

材料与方法：FACS分选受精后10天斑马鱼松果体缰细胞，应用两个单细胞测序平台进行测序分析--10x Genomics 及SMART-Seq2。

鉴定细胞类型和标记基因对于解剖神经发育和功能至关重要，但是脑的大小和复杂性阻碍了全面了所有了解所有细胞类型。松果体缰是一个参与疼痛处理和学习的保守性前脑中枢，研究将10x单细胞转录组与脑解剖相结合，得到了约13,000个松果体缰胞，确定了18种神经元类型和几十种标记基因，创建了全面的斑马鱼松果体缰单细胞图谱，为剖析松果体缰发育、功能及大脑其他区域的综合表征提供了总体框架。

果蝇

成年果蝇大脑细胞图谱绘制

A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Aging Drosophila Brain

期刊：Cell

影响因子：31.398

发表时间：20180402

材料与方法：共40只果蝇大脑（雌雄各半）8个时间点，10×Genomics单细胞转录组测序；FACS分选细胞，SMART-seq2、CEL-Seq2；两只果蝇大脑，ATAC-seq

果蝇大脑虽然只有大约10万多个细胞，其中85 % - 90 %为神经细胞，但却能编码广泛且复杂的行为，是进行功能研究的理想材料。研究构建了全面的成年果蝇大脑细胞图谱，达到了约1x“细胞覆盖率”；开发了SCENIC果蝇数据库，能映射出果蝇大脑中神经元和神经胶质类细胞的基因调控网络；绘制了大脑衰老过程中的细胞状态变化，利用机器学习的方法，根据细胞的基因表达谱来准确预测细胞的年龄。

图4  25k个细胞tSNE分布图

海鞘

脊椎动物神经嵴和脑神经基板共同演化起源

Shared evolutionary origin of vertebrate neural crest and cranial placodes

期刊：Nature

影响因子：41.577

发表时间：20180801

材料与方法：玻璃海鞘尾芽期胚胎，10×Genomics单细胞转录组测序

研究通过联合谱系追踪，基因编辑破坏和单细胞RNA测序分析，探索原始脊椎动物--玻璃海鞘侧板外胚层的特性。玻璃海鞘侧板与脊椎动物神经板外胚层的区室化存在显着的相似性，在玻璃海鞘中，这种区室化网络产生了不同但相关的感觉细胞类型。基因破坏导致一种感觉细胞类型转化为另一种感觉细胞类型。进一步研究双极尾神经元，发现其很容易转变为触诊感觉细胞，通过全胚胎单细胞RNA测序分析证实了转化存在。这些结果表明，侧板外胚层区块化是脊椎动物脑神经基板和神经嵴的共同演化起源。

海鞘全胚胎转录组图谱

Regulatory cocktail for dopaminergic neurons in a protovertebrate identified by whole-embryo single-cell transcriptomics

期刊：Genes & development

影响因子：9.462

发表时间：20180918

材料与方法：玻璃海鞘中期尾芽胚胎，10×Genomics单细胞转录组测序

玻璃海鞘的中枢神经系统包含一个多巴胺能（DA）神经元亚群--冠细胞，被比作脊椎动物的下丘脑。全胚胎单细胞RNA-seq结果表明Ptf1a是DA /冠细胞中特异性表达最显著的转录因子（TF），Ptf1a敲低导致DA /冠细胞消失。感光细胞和室管膜细胞最容易转化，两种细胞都表达高水平的Meis，并且Ptf1a和Meis的共表达导致整个CNS转化为DA /冠细胞。

图5 冠细胞位置示意图及标记基因分布图

蝾螈

蝾螈肢体再生

Single-cell analysis uncover sconvergence of cell identities during axolotl limb regeneration

期刊：Science

影响因子: 41.058

发表时间：20181026

材料与方法：美西钝口螈（Ambystoma mexicanum）上肢截肢后五个时间点芽基和正常组织对照，及三个肢芽阶段结缔组织细胞和芽基细胞对照，进行10×Genomics单细胞转录组测序

美西钝口螈前肢的截肢会形成芽基，作为再生新肢体的祖细胞来源。结缔组织（CT）细胞是最为丰富的细胞谱系，有助于促进芽基产生。研究联合使用Cre-loxP报告基因谱系跟踪和单细胞RNA测序（scRNA-seq），来追踪CT细胞谱系的再分化轨迹及肢体再生过程中特殊谱系的分子重建步骤。结果显示，芽基细胞具有肢芽祖细胞特性，能形成多能CT祖细胞。进入诱导再生时CT细胞表达会失去成体表型，之后的阶段能够重现胚胎类肢芽表型。

图6  蝾螈单细胞测序示意图及亚群聚类可视化结果

Tips:

基迪奥提供丰富的10xGenomics 单细胞测序服务，包括 5’端和3’端基因表达谱分析、单细胞免疫组库分析（T/B细胞）及10x单细胞ATAC-seq分析。对10x单细胞测序感兴趣的老师和同学可留言咨询，基迪奥生物有丰富的项目经验，提供专业的解决方案和一对一的个性化分析服务，技术团队会携带仪器上门服务！

参考文献

[1].Tabula Muris Consortium. Single-cell transcriptomics of 20mouse organs creates a Tabula Muris[J]. Nature, 2018, 562(7727): 367.

[2].Carter R A, Bihannic L, Rosencrance C, et al. A Single-CellTranscriptional Atlas of the Developing Murine Cerebellum[J]. Current Biology,2018, 28(18): 2910-2920. e2.

[3].Hernández P P, Strzelecka P M, Athanasiadis E I, et al.Single-cell transcriptional analysis reveals ILC-like cells in zebrafish[J].Science immunology, 2018, 3(29): eaau5265.

[4].Pandey S, Shekhar K, Regev A, et al. Comprehensiveidentification and spatial mapping of habenular neuronal types usingsingle-cell RNA-seq[J]. Current Biology, 2018, 28(7): 1052-1065. e7.

[5].Davie K, Janssens J, Koldere D, et al. A single-celltranscriptome atlas of the aging Drosophila brain[J]. Cell, 2018.

[6].Horie R, Hazbun A, Chen K, et al. Shared evolutionary originof vertebrate neural crest and cranial placodes[J]. Nature, 2018, 560(7717):228.

[7].Horie T, Horie R, Chen K, et al. Regulatory cocktail fordopaminergic neurons in a protovertebrate identified by whole-embryosingle-cell transcriptomics[J]. Genes & development, 2018, 32(19-20):1297-1302.

[8].Gerber T, Murawala P, Knapp D, et al. Single-cell analysisuncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration[J].Science, 2018, 362(6413): eaaq0681.