【干货】分子光谱分析法第四弹—分子荧光和分子磷光

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分子和原子一样，也有它的特征分子能级，分子内部的运动可分为价电子运动、分子内原子在平衡位置附近的振动和分子绕其重心的转动。因此分子具有电子能级、振动能级和转动能级。

分子从外界吸收能量后，就能引起分子能级的跃迁，即从基态跃迁到激发态，分子吸收能量同样具有量子化的特征，即分子只能吸收等于二个能级之差的能量，符合：⊿E＝E2－E1＝hν=hc/λ

由于三种能级跃迁所需能量不同，所以需要不同波长的电磁辐射使它们跃迁，即在不同的光学区域出现吸收或发射谱带。

 

某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法。

 

根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为：

光致发光：以光来激发而发光有分子荧光分析法和分总磷光分析法。

电致发光：以电能来激发而发光

生物发光：以生物体释放的能量激发而发光

化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发光分析法

 

分子发光光谱原理

分子在一定的能量辐射下，也会从低能级跃迁到高能级，当激发态分子以辐射跃迁形式释放能量，然后返回到较低能级或基态时，便产生分子发光，依据激发的模式不同，分子发光包括光致发光（荧光或磷光）、热至发光、场致发光和化学发光等。

 

处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式（荧光和磷光）或无辐射跃迁方式再回到较低能级的激发态或基态。无辐射跃迁：则是指以热的形式辐射其多余的能量。

各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构及激发时的物理和化学环境等因素有关。

分子荧光发射

处于第一激发单重态中的电子以辐射跃迁返回至基态各振动能级时，就产生了分子荧光。

由于激发态中存在有振动驰豫和内转化现象，使得荧光的光子能量比其受激发所吸收的光子能量低，因此荧光波长λ3较激发波长λ1或λ2都长。

注意：

不论电子开始被激发至什么高能级，最终将只发射出波长为λ3的荧光。荧光的产生在10-7-10-9s内完成。

分子磷光发射   

电子由基态单重态激发至第一激发三重态的几率很小，因为这是禁阻跃迁。但是，由第一激发单重态的最低振动能级，有可能以系间窜跃方式转至第一激发三重态，再经过振动驰豫，转至其最低振动能级，由此激发态跃回至基态时，便发射磷光，这个跃迁过程（T1→S0）也是自旋禁阻的，其发光速率较慢，约为10-4-10s。因此，这种跃迁所发射的光，在光照停止后，仍可持续一段时间。

荧光与磷光的比较

1.荧光是由激发单重态最低振动能级至基态各振动能级间跃迁产生；

磷光是由激发三重态的最低振动能级至基态各振动能级间跃迁产生的。

2.激发单重态的平均寿命大约为10-8s，荧光产生快，而激发三重态的平均寿命为10-3-10s，磷光产生稍慢。磷光寿命比荧光厂。

3.磷光辐射的波长比荧光长。

4.无论电子开始被激发至什么高能级，荧光和磷光的波长都是固定的。

激发光谱曲线和荧光、磷光光谱曲线

荧光和磷光均为光致发光，因此必须选择合适的激发光波长，可根据它们的激发光谱曲线来确定。

绘制激发光谱曲线时，固定测量波长为荧光（或磷光）最大发射波长，然后改变激发波长，根据所测得的荧光（磷光）强度与激发光波长的关系，即可绘制激发光谱曲线。

注意：

激发光谱曲线与其吸收曲线可能相同，但激发光谱曲线是荧光强度与波长的关系曲线，

吸收曲线则是吸光度与波长的关系曲线，两者在性质上是不同的。当然，在激发光谱曲线的最大波长处，处于激发态的分子数目是最多的，这可说明所吸收的光能量也是最多的，自然能产生最强的荧光。

 

绘制荧光或磷光光谱曲线：固定激发光波长为其最大激发波长，然后测定不同的波长时所发射的荧光或磷光强度即可。

在荧光和磷光的产生过程中，由于存在各种形式的无辐射跃迁，损失能量，所以它们的最大发射波长都向长波方向移动，以磷光波长的移动最多，而且它的强度也相对较弱。

 

荧光和分子结构的关系

分子产生荧光必须具备两个条件：

 ① 分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才能吸收激发光；

 ②吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定的荧光量子产率。

荧光发射光谱的普遍特性

1.Stokes位移

分子的荧光光谱的波长总是比激发光谱的波长要长，这种波长位移的现象称为Stokes位移。

2.荧光发射光谱的形状与激发波长无关

3.镜像规则，通常荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系。

溶液荧光猝灭

荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭。能引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂。

1.碰撞猝灭

2.静态猝灭（组成化合物的猝灭）

3.转入三重态的猝灭

4.发生电子转移反应的猝灭

5.荧光物质的自猝灭

不论是哪种猝灭，增大荧光物质的浓度均会使荧光猝灭效应增强，从而导致标准曲线向浓度轴弯曲，即使荧光强度降低。

著名的熄灭剂:

①  卤素离子

②  重金属离子

③  氧分子

④  硝基化合物

影响荧光强度的因素

1.溶剂

溶剂的影响可分为一般溶剂效应和特殊溶剂效应。

2.温度

低温下测定，提高灵敏度。

3.溶液pH值

大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光性质受溶液pH的影响很大。

共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具有各自的荧光效率和荧光波长。

4.内滤光作用和自吸收现象

溶液中若存在能吸收激发或荧光光能的物质，就会使荧光减弱，这种现象称为“内滤光作用”。在溶液浓度较大时，一部分荧光发射被自身吸收，产生“自吸收”现象而降低了溶液的荧光强度。

荧光分析仪

1.光源

2.两个单色器 (用于选择激发光波长和荧光波长)

3.液槽

4.检测器

5.信号显示记录器

由光源发射的光经第一单色器得到所需的激发光波长，通过样品池后，一部分光能被荧光物质所吸收，荧光物质被激发后，发射荧光。为了消除入射光和散射光的影响，荧光的测量通常在与激发光成直角的方向上进行。

 

为消除可能共存的其它光线的干扰，如由激发所产生的反射光、Raman光,以及为将溶液中杂质滤去，以获得所需的荧光，在样品池和检测器之间设置了第二单色器。荧光作用于检测器上，得到响应的电信号。

分子荧光分析法的特点

1. 灵敏度高

荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光强度，可提高荧光强度）。

采用高灵敏度的检测系统可大大提高灵敏度，荧光分析法的检测限比分光光度法低2~4个数量级。

2. 选择性好

不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发光波长。

不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光波长。

比较容易排除其它物质的干扰，选择性好。

3. 实验方法简单

4. 待测样品用量少；仪器价格适中。

发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物，广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧产品分析、卫生检疫等领域。

荧光法比磷光法应用广泛，不如分光光度法。

局限性：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、干扰测量的因素较多。

荧光分析法的应用

1.定量分析

（1）标准曲线法——最常用的定量分析方法。

（2）荧光猝灭法

（3）比较法

2.无机化合物的分析

无机化合物中，能直接产生荧光并应用于测定的为数不多，但与有机化合物生成发荧光的有机配合物后，进行荧光分析的元素达70多种，其中较常采用荧光法测定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd及某些稀土元素。

3.有机化合物的分析

脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本身能发荧光的很少，一般需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析。

芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发荧光；可直接用荧光法测定。对于具有致癌活性的多环芳烃——荧光分析法是最主要的测定方法。

为提高测定的灵敏度，有时也将芳香族化合物与适当试剂反应之后进行测定。

可测定结构复杂的大量有机物质，如：各种维生素、叶绿素、氨基酸、蛋白质、酶和辅酶

以及各种药物、毒物和农药等。

磷光分析法的应用

能产生磷光的物质数量很少，磷光分析不及荧光分析普遍，但磷光分析法已在药物分析、临床及环境分析领域得到一定的应用。

低温磷光分析已应用在萘、蒽、菲、芘、苯并芘等多环芳烃及含O、S、N的杂环化合物分析。

固体表面室温磷光分析法已成为多环芳烃和杂环化合物的快速、灵敏的分析手段。

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（内容来源：网络 由小析姐整理编辑）