 中科普瑞作为中国十万人甲基化组计划的执行方，对甲基化检测的相关技术进行了优化升级，建立了专业的甲基化检测一站式服务平台。 今天小编为大家介绍甲基化检测的金标准—焦磷酸测序技术，后面陆续介绍其他甲基化检测技术，敬请期待哦！ 焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）作为一种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测，已成为甲基化检测的金标准。 焦磷酸测序技术原理 焦磷酸测序技术是由4种酶（DNA 聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶）催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。  具体过程如下： 步骤1：扩增DNA片段并对焦磷酸模板链进行生物素化。通过变性，分离生物素化的单链PCR扩增子并使其与一条测序引物进行杂交。 步骤2：将杂交引物和单链模板与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和腺苷三磷酸双磷酸酶，以及底物腺苷-5'-磷酸硫酸酐（APS）和荧光素共孵育。 步骤3：第一个脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）被引入反应。DNA聚合酶催化dNTP，使其在互补模板链的情况下对测序引物进行延伸。每个核苷酸的添加都对应着等摩尔数焦磷酸（PPi）的释放。 步骤4：ATP硫酸化酶在腺苷-5'-磷酸硫酸酐（APS）存在的情况下将PPi转化为ATP。生成的ATP为荧光素酶介导的荧光素氧化反应提供能量，并生成与ATP的数量成比例的可见光。电荷耦合器（CCD）摄像头检测到荧光素酶催化反应所生成的光，并将其作为原始输出数据中的一个峰值（热解图Pyrogram）。每个峰值（光信号）的高度与核苷酸结合的数目呈比例关系。 步骤5：腺苷三磷酸双磷酸酶是核苷酸的降解酶，持续地对未结合的核苷酸和ATP进行分解。当分解完成时，便会引入另一个核苷酸。 步骤6：dNTP的添加反应在持续进行着。应注意脱氧腺苷三磷酸α-硫代三磷酸（dATPαS）能够作者为天然脱氧腺苷三磷酸（dATP）的替代物，被DNA聚合酶有效利用，却并不会被荧光素酶所识别。当反应进行时，逐渐合成了互补的DNA链，其核苷酸序列能够凭借热解图（Pyrogram）轨迹中的信号峰值来确定。 焦磷酸测序仪器平台  焦磷酸测序实验流程  样本要求  实验周期 样本质检合格后25个工作日。 中科普瑞焦磷酸测序服务 — 技术优势 ✦专业的引物设计评估，优化最佳的实验条件，全程软件控制减少人为因素影响； ✦高灵敏度，可检测包括测序引物区域在内的邻近CpG区域的单个甲基化水平； ✦周期短、通量高，最多可同时平行分析96个样本，一次运行可实现多个连续CpG位点定量分析； ✦快速获得直观无偏差序列数据，一次反应最大可获得100 bp以上高精度读长； ✦样品要求低，适用于新鲜、冷冻和FFPE样本。    中科普瑞，旗下拥有上海鲸舟医学检验实验室有限公司和上海鲸舟基因科技有限公司，立足新一代测序及其衍生技术，以医学生物信息学为核心，提供覆盖肿瘤等重大疾病风险评估，早期筛查，分子病理诊断，肿瘤精准用药指导和预后预测等符合临床需求的解决方案，为精准医疗打造全方位服务平台。公司的中长期发展策略为医学大数据挖掘和人工智能的临床应用。
公司是十万人甲基化组计划（表观星图计划）项目实施方，拥有专业的多组学技术服务团队，成熟的团队和技术平台提供基因组、转录组、表观基因组、代谢组等多组学的实验分析和生信分析，以及多维度因果关联分析，为广大医学和生物学研究人员提供专业的一站式服务。 |
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