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摘 要 教你如何选择Akt各磷酸化位点，以及它们的功能及区别。 正 文 Akt家族简介 Akt也被称为蛋白激酶B (protein kinase B，PKB)，是一种分子量约为60kDa的丝/苏氨酸蛋白激酶，存在于哺乳动物中的三种同工型。AKT可分为3种亚型 (AKT1、AKT2、AKT3或PKBα, PKBβ, PKBγ)，3种亚型的功能各异，但也有重叠。AKT1 广泛地分布在组织中，Akt2主要分布在肌肉和脂肪细胞中，而Akt3则在睾丸和大脑中表达。Akt 调控多个生物过程，包括细胞存活、增殖、生长和糖原代谢，Akt信号通路与恶性肿瘤、糖尿病、类风湿关节炎等多种疾病的发生发展密切相关，越来越受到广泛的关注【1-3】。 许多生长因子、激素与细胞因子通过结合其同源受体酪氨酸激酶 (RTK)、细胞因子受体或 GPCR，以及通过触发脂质激酶 PI3K 的活化来激活 Akt，从而在细胞质膜中生成 PIP3。Akt 通过其普列克底物蛋白同源 (PH) 结构域与 PIP3 相结合，导致 Akt 转位至细胞膜。通过双磷酸化机制，可以激活 Akt。同样因为自身 PH 结构域而转位至细胞膜的 PDK1，能够活化Akt的Thr308 位点使 Akt 磷酸化，PDK2再对Akt的Ser473 位点磷酸化才能最后导致其完全活化，也就是说羧基末端 Ser473 位点的二次磷酸化对于活性来说也是必要的，并由 mTOR-rictor 复合体 mTORC2 完成, 活化的Akt引起下游磷酸化级联反应和靶蛋白之间的相互作用详见图1 [4]。  图1： PI3K-Akt信号通路简图。 让我们来看下Akt的表达定位，一般在静止的细胞是位于细胞浆的，在被生长因子等激活之后，Akt由细胞浆转移至细胞膜内测，活化后的AKT进入细胞浆和细胞核，通过使下游底物蛋白磷酸化而激活（如图2）。  图2：使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb（绿色），对经 LY294002 处理（左）或经胰岛素处理（右）的 C2C12 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。肌动蛋白纤丝用 Alexa Fluor® 555 phalloidin #8953（红色）进行标记。蓝色伪彩 = DRAQ5®#4084（DNA 荧光染料）。 Akt磷酸化位点选择 大家经常会有这样的困惑，对于常见的p-Akt（Thr 308） 和 p-Akt（Ser 473） 位点，到底该选择哪个位点？ 在细胞许多生物学功能中，PI3K/Akt信号通路发挥重要的调控作用，在细胞内起抑制凋亡，促进增殖的作用。作为PI3K的下游蛋白，Akt主要有两个重要的磷酸化位点Thr308和Ser473。PI3K 不能直接活化Akt, 它是通过与细胞内含有PH 结构域的信号蛋白Akt和磷脂酰肌醇依赖激酶I（phosohoinositide-dependent kinase 1， PDK1）结合 （图3），诱导Akt到细胞膜上，然后催化Akt蛋白的Thr 308位点发生磷酸化，从而部分激活Akt，但是Akt功能活性的充分发挥还需要Ser473的磷酸化【5】。在许多细胞系（尤其是肿瘤细胞系）中，对Akt功能的抑制多是通过抑制PI3K的功能（如使用PI3K特异性抑制剂LY294002和Wortmannin）而实现的，以p-Akt（Ser473）表达含量的降低为主要指标。PTEN蛋白是PI3K/Akt信号通路的主要负调节蛋白【6】，拮抗PI3K和Akt，使PIP3 脱磷酸，通过抑制Akt磷酸化并使其去磷酸化，使得细胞中的Akt磷酸化水平降低，从而阻断PI3K/Akt信号通路，抑制细胞生长，促进细胞凋亡【7-9】。  Front. Biol. 2013, 8(2): 160–174 图3: PI3K 不能直接活化Akt；PTEN 磷酸酶是 PI3K/Akt 信号转导通路的主要负向调节分子。 Thr308和Ser473两个位点的激酶可能不同，PDK1磷酸化Akt308，而mTOR激活Akt473，一些研究表明Thr308的磷酸化会促进Ser473的磷酸化，因为AKT激活的磷酸化顺序一般是先Thr磷酸化后Ser磷酸化，即Thr磷酸化后Akt一般都激活了。膜上的 PDK1 在 AKt 的Thr 308 位点将其磷酸化，导致 Akt 的部分激活。Ser 473 位点被 mTORC2 磷酸化，可激发Akt 的完全的酶活性。在选择位点的时候，可以从作用的激酶来推测哪一个位点可能会发生变化，最直接的位点是检测Ser473，如果两者都检测的话那自然是比较好的。 这里还有一个建议，看看这两个位点发生磷酸化修饰对生物学功能的影响。如果是做细胞凋亡、细胞周期、细胞骨架重组、癌症相关的话，Thr308和Ser473两个位点都可能参与其中；如果研究细胞分化，可能需要多关注下Ser473位点；和蛋白降解相关的一般是Ser473位点；在非小细胞肺癌的研究中，可能与Thr308位点的磷酸化高度相关（见图4，来自PhosphositePlus网站）。但是必须要注意的是，信号通路错综复杂，最好还是结合文献，来推测所需检测的磷酸化308位点。  图4：Akt磷酸化位点发生修饰对生物学功能的影响。 说完了磷酸化Akt位点的选择，接下来就到实验疑难解答环节，Akt没有WB条带怎么破，请继续关注我们的下一期文章“如何处理样本才能得到Akt的磷酸化条带”，从样本处理入手，带你一探究竟。 【参考文献】 1.PI3K: downstream AKTion blocks apoptosis. Franke, T.F. et al. (1997) Cell 88, 435-7. 2. Protein kinase B (c-Akt) in phosphatidylinositol-3-OH kinase signal transduction. Burgering, B.M. and Coffer, P.J. (1995) Nature 376, 599-602. 3. The protein kinase encoded by the Akt proto-oncogene is a target of the PDGF-activated phosphatidylinositol 3-kinase.Franke, T.F. et al. (1995) Cell 81, 727-36. 4. Evi1 forms a bridge between the epigenetic machinery and signaling pathways. Yoshimi A1, Kurokawa M. Oncotarget. 2011 Jul;2(7):575-86. 5. Physiological regulation of Akt activity and stability. Liao Y, Hung MC. 《American Journal of Translational Research》 , 2010 , 2 (1) :19 . - To Be Continued - |
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