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干细胞标志物ALDH1A1通过维甲酸/HIF-1α/VEGF信号通路促进乳腺癌细胞血管生成

 生物_医药_科研 2019-01-04

 


今天为大家介绍的是一篇关于醛脱氢酶1A1ALDH1A1对乳腺癌细胞中血管生成因子的产生和调节肿瘤血管生成作用的研究,作者是意大利锡耶纳大学生命科学系的Valerio Ciccone


醛脱氢酶1A1ALDH1A1),醛脱氢酶家族成员, 是乳腺癌干细胞的标志。据报道,在肿瘤进展过程中,肿瘤干细胞(CSCs)可分泌血管生成因子,参与组织病理性血管生成,而血管生成在肿瘤的进展中起着至关重要的作用。ALDH1A1在介导乳腺CSCs血管生成表型和肿瘤新生血管形成中的潜在作用尚不为人们所知。ALDH1A1同工酶将视黄醛氧化为维甲酸(RA)Ra通过RARRXR核受体调控多种基因的表达,这些受体控制具有RA反应元件(RARES)的靶基因的转录。在某些乳腺癌细胞系中,维甲酸诱导基因的表达影响肿瘤的生长和转移。


此文中,研究者用体外成球能力评价乳腺癌细胞的干细胞状态。采用Transwell系统研究了人脐静脉内皮细胞(HUVEC)与含不同水平ALDH1A1的乳腺癌细胞(MCF-7)共培养时的血管生成特征,并观察了内皮细胞的增殖、迁移、管壁形成和通透性。此外,在体内,还将mcf-7细胞异种移植在免疫缺陷小鼠体内评估血流量、血管生成因子的表达和微血管密度(MVD)



1、在乳腺癌所有细胞系中,MCF-7ALDH1A1的表达和活性最高

    



1. ALDH1A1在各种乳腺癌细胞中的表达及活性

a.10%FBS培养乳腺癌细胞中ALDH1A1RT-PCR分析;b. Western blot分析ALDH1A1 c . 通过肿瘤细胞NADH的形成来测定ALDH1A1活性的变化。



2MCF-7乳腺癌细胞中ALDH1A1的活性与干细胞和血管生成有关

    



2Mcf-7 ALDH1A1对离体干细胞的影响

a. 在各类乳腺癌中具有代表性的肿瘤球图像; b . 函数损失模型中,MCF-7 ALDH1A1基因置乱序列(SCR)、MCF-7 ALDH1A1基因敲除(ALDH1A1KD)、 MCF-7高度表达ALDH1A1的细胞(ALDH1A1+)的肿瘤球的典型图像; c. MCF-7肿瘤球的定量研究; d.  Westernblot分析MCF-7SCRMCF-7ALDH1A1KDMCF-7ALDH1A1+肿瘤球中的干细胞标记CD133KLF4 e . MCF - 7 SCRMCF - 7 ALDH1A1KDMCF - 7 ALDH1A1 +肿瘤球中ALDH1A1, HIF-1αVEGF的蛋白质印迹分析。



3MCF-7细胞中ALDH1A1活性通过维甲酸信号调节血管生成,尤其是选择性RAR途径

    



3.MCF-7 ALDH1A1通过维甲酸信号调节血管生成因子的输出。

a . 血管生成因子在CM037(1μM)作用48h后上清液中的释放评价; b. MCF-7 细胞在不同浓度(110μM)CM037作用18h后,进行Western blot分析; c. CM 037(1μM18h)处理细胞,ELISA法检测MCF-7条件培养液中VEGF水平。18h后取培养上清液,固定细胞,染色计数; d. MCF-7 SCR,MCF-7 ALDH1A1KD MCF-7 ALDH1A1+在含10%FBS的培养基中培养48h后的VEGF进行了dRT-PCR分析;e. 缺氧或不缺氧组MCF-7VEGFHIF-1αwestern blot分析; f.  e所报告的印迹的数量; g. ELISA 法检测MCF-7细胞条件培养液中可溶性VEGF的表达.细胞密度为3×104/孔,接种于24孔板中.48h后取上清液固定细胞,染色计数; h. western blot方法检测MCF-7 ALDH1A1KD细胞在外源性维甲酸作用48h(1μM)HIF-1αVEGF的表达;  i. RAR拮抗剂(AGN193109)RXR拮抗剂(UVI3003)作用48h(1μM)HIF-1VEGFMCF-7 ALDH1A1+ 中表达; j.  MCF-7HIF-1α瞬时沉默VEGFCD 133的表达。注:因杂志排版问题,未能将图e.f.g.h.i.j完全展现出。



4ALDH1A1以血管内皮生长因子依赖的方式调节血管生成

    



4. mcf-7ALDH1A1VEGF依赖的方式调节内皮细胞的血管生成特征

a.MCF-7(Scr,ALDH1A1KD, ALDH1A1+)72h暴露于外源性血清(10%FBS)VEGF(220 ng/ml)后,用MTT法测定其活力;  b. McF-7HUVEC共培养48h(1%FBS),加入贝伐单抗(100ng/ml),经固定、染色、计数。与未加贝伐单抗的MCF-7 SCR共培养的HUVEC比较; c. 肿瘤细胞与MCF-7共培养18h(1%FBS),加入100 ng/ml的贝伐单抗。数据报告为迁移率的百分比(18h的面积百分比/0小时的面积)  d. 基质胶层和MCF-7共培养18h(1%FBS),对HUVEC的分枝点进行定量; e. HUVEC网络的代表性图片;f. 肿瘤细胞接种于12孔板底部,传代HUVEC。这些细胞一直保持在共培养中,直到贝伐单抗(100 N)存在或不存在时HUVEC单层形成;  g. HUVECMCF-7共培养,直至贝伐单抗(100ng/ml)融合。用共聚焦显微镜(TCS SP5 Leica)获得VE-钙粘蛋白的免疫荧光图像。注:因杂志排版问题,未能将图f. g.完全展现出.



5ALDH1A1在体内介导肿瘤生长和血管生成

    



5. ALDH1A1对无胸腺裸鼠MCF-7移植瘤的肿瘤生长和血管流量的影响。

a. 23天肿瘤体积 b. 23天肿瘤重量; c. 瘤体积和血管百分比,红色区域显示血流d. 肿瘤血管量化;e. 肿瘤体积量化。




6. ALDH1A1对肿瘤血管生成和体内VEGF生成的影响。

a. 冷冻肿瘤组织匀浆,提取RNA,进行 RT-PCR分析VEGF, HIF-1α ALDH1A1mRNA

b. VEGFALDH1A1蛋白在肿瘤标本中的表达;c. 肿瘤组织中CAIX(HIF-1α靶基因)和干细胞标记物(SOX 2NANOGOCT-4TWITE)基因表达的评价;d. 肿瘤组织中HIF-1α和干细胞标记蛋白(CD133KLF 4SOX 2)的检测;e. d所报告的印迹的数量;f. CD31染色法对微血管密度进行定量分析;g. CD 31(红色)DAPI(蓝色)在肿瘤切片中的代表性图像,分别来自SCR()ALDH1A1KD () ALDH1A1+ ()小鼠;h. CD 31(红色)NG2(绿色)双免疫染色在SCR()ALDH1A1KD ()ALDH1A1+ ()小鼠中的代表性图像。DAPI染色是蓝色的. 注:因杂志排版问题,未能将图d.e.f.g.h完全展现出.



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