WGCNA在植物circRNA研究中的应用

模式植物水稻和拟南芥转录组研究显示环状RNA广泛分布于植物中，同时植物环状RNA与动物一样存在特定的时空表达模式；此外，植物环状RNA与动物相比具有一些明显的特征，如非non-GT/AG剪切信号的环状RNA大量存在。

对于农学经济植物的研究也是近两年才刚刚起步（表1），目前主要工作集中于环状RNA数量鉴定和差异表达研究，对植物环状RNA的功能作用和形成机制等深入研究还存在很大的空白。

表1. 已报道的植物circRNA

下面以一篇文章为例，看看植物环状RNA目前的主要研究内容，以及WGCNA在其中的应用。

研究背景

猕猴桃（Kiwifruit）是一种重要的经济水果，Pseudomonas syringae pv. actinidiae （Psa）引起的溃烂病（canker disease）给全球的产业带来严重的损失。由于对宿主−病原互作相关分子生物学机制了解很少，目前多种病害控制策略都不能很好的对病原（Psa）感染进行有效控制。尽管已有报道模式识别受体蛋白（PRRs）genes、resistance（R）genes和转录因子（TFs）与植物免疫有关，CircRNA和免疫基因间的关系以及在植物免疫应答中的作用还未报道过。

样本选择和建库

• 研究组织表达模式：样本Ac-derived cultivar “Hongyang”（AH）的叶、根和干组织（每个样本两个生物学重复，共6个去核糖体RNA文库）。

• 研究不同栽培种和品种中特有的、与病原感染相关circRNA：Psa感染A. chinensis（AH和AJ）、A. eriantha（Ae）和A. argute（Aa）叶组织后不同时间点day post incubation（0、2、14 DPI）（每个样本两个生物学重复，共24个去核糖体RNA文库）。

研究思路

研究结果

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circRNAs测序数量统计和可变剪切分析

在30个RNA文库中总共鉴定到3582个circRNAs，根据其基因组位置信息可分为：基因间区、外显子型和内含子型circRNAs。与水稻和拟南芥circRNAs主要来源于编码基因情况不同，猕猴桃不同组织和品种中基因间区circRNAs数量最多，约占51%和67%（图1A）。

此外，同一基因组区域可以通过可变剪切产生不同类型的circRNA isoforms。作者总共发现4种不同类型，总共163个可变剪切（图1B）。不同品种在感染不同时间点的可变剪切事件比较稳定，此外2 DPI和14 DPI的剪切数相同，暗示circRNA在感染过程中稳定表达（图1C）。随机选取80个circRNAs进行PCR验证，其中68个circRNAs能够被实验证实，并且不同类型circRNAs比例相同，说明不同类型的circRNA都稳定的表达（图1D）。

图1. (A) 不同猕猴桃组织和品种中三种类型circRNA数量分布

(B) 可变剪切发生情况（AS events）：A3SS, alternative 3’ splice site；A5SS, alternative 5’ splice site；ER, exon skipping；IR, intron retention

(C) 病原感染不同栽培种和品种不同时间点可变剪切情况

(D) PCR和sanger测序验证Ac_ciRNA_11553示意图

2

猴桃circRNAs表达模式研究

对不同组织的circRNAs表达发现，约有59.67%只在一种组织中特异表达，三种组织中共有表达的只占17.97%。PCA也将三个不同组织聚成明显的三类，说明猕猴桃circRNAs具有组织特异性表达特征（图2A, 2B）。

不同栽培种/品种叶组织中，81.3%的circRNAs具有品种特异性表达特性（图2A），PCA也将样本聚成三类A. chinensis（AH和AJ）、A. eriantha（Ae）和A. argute（Aa）（图2E）。

图2. 猕猴桃不同组织和品种中circRNAs表达情况

3

猕猴桃circRNAs和来源基因的表达关系

作者计算circRNAs和其来源基因的表达相关系数，发现exon-circRNAs和intron-circRNAs与来源基因分别有15.33%和19.64呈正相关，有8.33和5.19%与来源基因负相关（p < 0.05）。说明多数exon-circRNAs和intron-circRNAs能够提高其来源基因的表达（图3B）。

利用同时能够产生exon-circRNAs和intron-circRNAs的来源基因，比较exon-circRNAs和intron-circRNAs对其的影响，发现intron型的相关性比exon型要显著，说明intron-circRNAs在其来源基因的表达调控中扮演更重要的作用（图3C）。

图3. CircRNA与其来源基因表达的相关性

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circRNAs和编码基因共表达网络研究

为了研究circRNAs在病原感染过程中的作用，作者利用WGCNA挖掘相关基因。利用鉴定的circRNA数据和通过转录组数据注释的编码基因数据，先筛选品种间至少一个差异对的8700个编码基因和584个circRNAs，再将这些编码基因的FPKM matrix和circRNAs的RPM matrix整合一起进行共表达分析，总共得到28个相同表达模式的模块（图4）。

根据模块内基因将模块分为三大类，进而将模块基因与三种生物学特征关联起来，发现模块17和18显著与多种特征相关。28个模块中有15个与Trait 3（不同种）相关，作者重点关注这些种间差异的模块基因。

图4. WGCNA分析猕猴桃编码基因和circRNAs共表达模式

为了研究各品种间的病原易感和耐受情况，作者对种间显著相关的模块基因进行共表达分析，通过Cytoscape产生几个大的基因集包括：the R genes、PRR genes、TFs以及co-expressed circRNAs（图5B）。

根据WGCNA的结果，作者建立了一些subnetworks，主要关注特定circRNA与其相关的编码基因和circRNAs的关系，挖掘一批与circRNA相关的特定编码基因（CAPC）。利用GO对这些CAPC进行功能注释，发现显著关联于植物-病原互作功能，尤其在那些品种间差异的circRNA的网络中，这一结果暗示circRNA在植物-病原互作中发挥一定的功能（图5C）。

总结

1. 作者设计了多样本测序策略，从多角度研究了猕猴桃不同栽培种/物种、不同组织中以及病原感染不同时间点的circRNA数量和表达模式，发现了circRNA具有组织特异性和种间特异性表达的特征。

2. 通过研究circRNA和其来源基因的表达关系发现，正相关基因pairs多于负相关，说明猕猴桃circRNA对其来源基因表达有一定的促进作用。

3. 利用WGCNA分析了多组编码基因和circRNAs和数据，将不同的模块基因与三种生物学特征关联，进而关注不同种间显著相关的模块基因，并对其功能进行注释，发现circRNAs参与了植物-病原互作的生物学过程。

4. 这篇文章侧重于circRNA的表达模式研究，结果表明circRNA的生物学调控可能是比较复杂的，不仅本身具有特异性表达特征，还能通过编码基因-circRNA、circRNA-circRNA互作发挥功能。

5. 对筛选的circRNAs的功能机制还需要做深入的研究，才能更好阐释植物circRNAs采用何种形式发挥功能，如：miRNA sponge、转录调控、蛋白翻译等。

□ WGCNA分析在高分文章中的应用

参考文献：

【1】Wang Z, Liu Y, Li D, et al. Identification of Circular RNAs in Kiwifruit and Their Species-Specific Response to Bacterial Canker Pathogen Invasion[J]. Frontiers in Plant Science, 2017, 8.