2019年Science论文揭示遗忘的分子机制---遗忘是为了新的学习

记忆的物质基础是什么？大脑中，记忆就是一种分子或细胞水平的改变。连接于神经元之间神经突触能通过细微地调节神经元之间的交流效率而存储记忆。突触可塑性实现了大脑对记忆的储存与唤起。遗忘就是让记忆消退或潜藏。然而，我们为什么会忘记？什么决定了一个记忆的遗忘呢？

这篇发表在2019年Science杂志的论文发现了一种机制就是调节突触后质膜上的神经递质受体的数量。突触后膜是调控突触强度的关键因素，其上的受体介导了前突触释放的神经递质转化成为电信号的过程。多插入一些受体提升了突触的能力，移除一些受体也就降低了突触的能力。这些受体的迁移受神经元钙离子流入而控制。

突触结合蛋白（synaptotagmin）负责感受到钙离子水平的改变并且引发膜融合。大部分突触结合蛋白在钙离子的作用下，转移到质膜上，然而，突触结合蛋白3 （Syt3）却从突触后膜内化到胞质。刺激AMPA或NMDA受体，可诱导AMPA受体和Syt3内化，其中AMPA受体介导大脑中大部分快速的突触传递行为。

1首先证明Syt3位于突触后膜的内吞区域

作者首先证明Syt3位于突触后膜的内吞区域，这一区域富含网格蛋白（clathrin）并接近突触后致密区（postsynaptic density，PSD）。Syt3在脂肪组织、心脏和脑组织中最丰富，脑中可见于海马体、皮质、丘脑和纹状体。下图显示海马体切片CA1区的锥体细胞体进而树突上可检测到Syt3，其中MAP2是树突的标志。识别Syt3的特异性抗体分别由这项研究团队和NeuroMab公司制备。

Syt3主要表达于海马体神经元的树突。下图中海马体神经元转染了绿色荧光蛋白（GFP）基因，其中GFP阳性MAP2阴性的是轴突。

作者又进一步聚焦，发现Syt3位于突触位置，即突触素（Syp）和PSD95阳性的区域（下图）。

然而，上图不足以清晰地说明Syt3是位于前突触还是后突触。作者又使用了一种突触体实验，可封闭前突触的末端，使突触囊泡与前突触成分封闭在内，保护其不受胰酶降解，如下图的Syp、Syn、Syb2等。而后突触不受影响，其成分可被胰酶降解，如下图中的PSD95、Homer、GluA1等。其中，Syt3 NB是以NeuroMab公司制备的抗体检测Syt3；Syt3 NT是以课题组制备的抗体检测Syt3。

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既然Syt3位于后突触，那么它可能参与后突触成分的循环利用

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延时成像技术显示，AMPA或NMDA刺激可诱导荧光标记的Syt3内化，但是没有钙离子的情况下，不会发生内化（下图）。

下图也是说明AMPA或NMDA可以诱导Syt3内化，实验所用的海马体神经元为Syt3敲除细胞，再转染了GFP标记的重组Syt3。作者还发现，GFP-Syt3与网格蛋白轻链（CLC）共定位，而不是与Homer共定位。

2探究Syt3具体与哪些蛋白之间相互作用

a.脑组织匀浆的Pull-down实验显示（下图），Syt3可与GluA2、AP2和BRAG2，图中Syt3-组为仅含有微珠的阴性对照组。并且，这三种蛋白与Syt3的结合取决于钙离子水平，0 Ca²⁺组也并非没有钙离子，EGTA才能够去除痕量的钙离子。为了进一步发现，GluA2与Syt3的结合部位，作者合成了GluA2 C末端的肽段Tat-GluA2-3Y（Tat结构域赋予该多肽穿过细胞膜的功能），添加该肽段即可干扰Syt3对GluA2的pull-down，说明Syt3仅与GluA2的C末端结合。

由于GluA1与GluA2的异二聚体是海马体中AMPA受体的主要类型，作者还是猜测是否Syt3可以通过作用于含有GluA2的受体，而使受体内化。下图显示，通过AMPA或NMDA刺激，Syt3可以介导受体内化。表面的受体以抗体直接检测，内化的受体先破坏细胞膜通透性后再检测。柱状图反映的是内化了的GluA2与膜表面的GluA2的比值。

• 没有AMPA或NMPA刺激不会发生受体内化，
  

• 敲除Syt3不会发生受体内化，

• 转染不能结合钙离子的突变Syt3也不会发生受体内化，

• 而过表达GFP-Syt3则增加受体内化水平。

• 加入Tat-GluA2-3Y多肽后，该多肽与GluA2竞争结合Syt3，因此，也不会发生受体内化。

b.作者通过小鼠海马体切片进行实验，证明Syt3促进长时程抑制（LTD）以及长时程增强（LTP）的衰减。长时程抑制需要AMPA受体内吞作用。然而，敲除Syt3、以GluA2-3Y多肽干扰Syt3都能破坏长时程抑制（下图A）。另外，敲除Syt3也能强化长时程增强（B）。

c.考虑到Syt3感受钙离子的功能，作者在Syt3敲除小鼠的海马体CA1区注射了不能结合钙离子的Syt3突变体或野生型的Syt3的表达载体（下图H）。结果显示，长时程抑制和长时程增强的衰减可以被野生型的Syt3拯救但不能被Syt3突变体拯救（J）。

3之后，研究进入动物实验水平

他们使用水迷宫实验来测试小鼠的空间记忆，因为该项能力涉及海马体的CA1区。Syt3基因敲除小鼠和野生型小鼠在记忆水池中隐藏的平台方面表现相同（下图）。

然而，在改变水池中平台的位置后，野生型小鼠前10-20秒先去原位置寻找平台，之后再去水池中不同的区域寻找平台，但是Syt3基因敲除小鼠则一直前往原来的位置寻找平台。

（上图中红色圆形代表水池中平台的所在位置，热度图则反映小鼠停留位置的频次）

小鼠海马体CA1区注射Syt3表达载体，能够拯救基因敲除小鼠的表现（下图）。野生型小鼠海马体注射Tat-GluA2-3Y多肽也降低了它们遗忘的能力，即出现在原来平台位置的频次增加。

作者又进一步证明由于遗忘的机制受损Syt3敲除小鼠的工作记忆较差。作者连续对两组小鼠开展水迷宫实验，先连续3天记忆可见的平台，两组小鼠的表现同样好。在隐藏平台的第二段训练（5-8天）里，野生型小鼠学习的表现就好于基因敲除小鼠。因为，基因敲除小鼠总是去往原来平台的位置而导致学习新位置的表现差（下图B），图示中红色圆形表示当前平台的位置，橘色为前1天平台的位置，黄色为2天前平台的位置。图中C、D表示Syt3基因敲除小鼠出现的位置都更接近于先前的平台位置。