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一文掌握Annexin V-FITC/PI细胞凋亡实验方法

2019-01-21  心随所愿zh
一、技术原

      细胞凋亡(apoptosis)是指细胞在一定的生理或病理条件下,受内在遗传机制控制,按照自身程序主动性、生理性的死亡过程。细胞凋亡受凋亡相关基因调控,故又称为程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)。

      一般来说,凋亡早期,主要涉及胞内一些蛋白的变化,例如蛋白量的增高、位置的迁移、状态的改变等,还有一些磷脂、Ca2+的变化等;中晚期则伴随着DNA的断裂、凋亡小体的形成;而细胞形态的改变则伴随着整个凋亡过程。


二、产品应用
       目前可以采用单染色法和双染色法对细胞进行染色,流式细胞仪检测或荧光显微镜观察来检测细胞凋亡,其中Annexin V/PI法是当下较为流行的检测细胞凋亡的方法。正常细胞中,磷脂酰丝氨(phosphotidylserine,PS)位于细胞膜的内侧,但在早期凋亡细胞中,PS会从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin-V(膜联蛋白-V)是一种分子量为35-36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力结合。用荧光素(FITC、Alexa Fluor488等)标记的Annexin-V作为探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生;碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞,PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。因此将Annexin-V与PI结合使用,就可以检测出细胞群体中的早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞。

 Apoptosis-AnnexinV 检测示意图


      

碘化丙啶PI检测示意图


三、使用方法
1
悬浮细胞,2000rpm离心5min收集细胞;对于贴壁细胞,要用不含EDTA的胰酶消化细胞,胰酶消化时间不宜过长或过短(过长细胞膜破碎,造成假阳性,过短,细胞黏连影响检测)最好是在轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时,吸除胰酶消化液,加入细胞培养液终止消化,,2000rpm离心5min收集细胞;
2
4℃预冷PBS,洗涤细胞2次(2000rpm x 5min),收集细胞2~5×105 ;
3
离心弃上清,加入500μL结合缓冲液,轻轻吹打重悬细胞;
4

加入5μL Annexin V-FITC,轻轻吹打混匀,加入5μL PI 轻轻吹打混匀,室温避光孵育5-15min。(PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高,时间允许,可以在检测前5分钟加入PI);

5

流式细胞仪检测或荧光显微镜观察。最好在1h内检测。


四、注意事项
1
Annexin V-FITC与PI量微,请在使用前低速离心将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落;
2
Annexin V-FITC与PI需低温避光储存;
3
PI有毒,能透过皮肤进入体内,使用时注意防护;
4

本试剂盒适用于细胞样本(不能固定),不适用于组织检测;

5

所有细胞在检测前细胞密度达80%-90%左右即可,细胞过密过多会导致细胞本身的大量凋亡,从而增加了凋亡细胞的比例;

6

对于贴壁细胞,可直接用盖玻片培养细胞并诱导细胞凋亡;细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞;

7

包括漂浮在培养基上的细胞,一起收集;洗细胞后,建议轻轻摇匀细胞沉淀,避免使用加液枪,以免由于塑料枪头的使用造成细胞损失;

8

一次检测很多样本,加入PI应该有一定的时间间隔(一般以30~60s为宜),因为PI本身有毒;


9

如果样品来源于血液,请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS,能与Annexin V结合,从而干扰实验结果;


10

尽量去除EDTA,EDTA会影响Annexin V与PS的结合。

五、常见问题
1
成功的检测凋亡受以下几种因素的影响,如细胞类型、细胞膜上PS的密度、发生凋亡时PS翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间等,把这些影响因素进行优化对实验成功与否至关重要;
2
荧光显微镜观察:滴一滴用Annexin V-FITC/PI双染的细胞悬液于载玻片上,并用盖玻片盖上细胞。在荧光显微镜下用双色滤光片观察。Annexin V-FITC荧光信号呈绿色,PI荧光信号呈红色;
3
使用流式细胞仪正确分析Annexin V-FITC/PI双染的细胞前要求仪器的荧光补偿来去除两种染料激发光之间的叠加。因为荧光补偿设置与PMT的电压直接相关,所以不同仪器之间的补偿不同。建议在实验开始阶段分析经Annexin V、PI分别单染的细胞来调整荧光补偿去除光谱重叠。根据未处理细胞空白对照和经Annexin V、PI分别细胞染色后的单染对照的分析设定十字门的位置;
4

正常细胞:Annexin ⅴ-FITC (-);PI (-); 

早期凋亡细胞:Annexin ⅴ-FITC (+);PI (-);

晚期凋亡细胞: Annexin ⅴ-FITC (+);PI (+);

机械性坏死:Annexin ⅴ-FITC (-);PI (+);

5

对照组凋亡比例高的原因:

  • 细胞状态不好; 

  • 细胞收集后存放的时间太长,没有及时染色; 

  • 细胞表面原有的PS相对较多,应选用低浓度的AnnexinV标记;

  • PBMC表面往往有血小板黏附在细胞表面,造成Annexin V阳性率偏高;

  • 过分吹打、震荡或胰酶消化等,可能使PS暴露出来。

6

处理组凋亡比例低的原因:

  • 凋亡刺激得不够; 

  • 细胞本身生长状态可能对刺激因素不敏感,如过度增殖的细胞对凋亡的诱导不太敏感;

  • Annexin V的结合缓冲液失效,应4 ℃保存; 

  • 贴壁细胞消化时间过长,膜表面的PS受损,Annexin V结合位点减少。

六、实验图例

1.凋亡诱导剂喜树碱(Camptothecin,CPT)10uM诱导Jurkat细胞,37℃,5%CO培养4h,参照说明书操作,经流式细胞仪检测结果如下:

处理前 :正常细胞占比较高,早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞较少。

(红色部分为正常细胞,蓝色为早期凋亡细胞,绿色为晚期凋亡细胞,品红为机械性坏死细胞 )

处理后:正常细胞明显减少,早期凋亡细胞明显增加 。     

(红色部分为正常细胞,蓝色为早期凋亡细胞,绿色为晚期凋亡细胞,品红为机械性坏死细胞 )


2.凋亡诱导剂喜树碱(Camptothecin,CPT)10uM诱导Jurkat细胞,37℃,5%CO培养4h,参照说明书操作,经荧光显微镜观察结果如下:

正常细胞:无染色  

早期凋亡细胞:只有膜绿色荧光染色   

晚期凋亡细胞:既有膜绿色荧光染色,也有核红色荧光染色    

 机械性坏死细胞:只有核红色荧光染色。

七、相关产品

Annexin V-FITC /PI凋亡试剂盒(点击查看详情)

产品货号:MK1028

产品价格:618元/100μl  1098元/250μl  1680元/500μl  

试剂盒主要试剂为Annexin V-FITC 及PI,应用于细胞凋亡检测

试剂组分

MK1028-20(20次实验)

MK1028-50(50次实验)

MK1028-100(100次实验)

Annexin V-FITC

100μL

250μL

500μL

Propidium Iodide(PI)

100μL

250μL

500μL

Binding Buffer

10mL

25mL

50mL

保存条件:Annexin V-FITC与PI需4℃避光储存, Binding Buffer在4℃储存,一年有效。

END


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