|
神经元核内包涵体病（Neuronal Intranuclear Inclusion Disease，NIID）是以中枢和外周神经系统以及内脏器官内嗜酸性透明包涵体为特征的一种罕见的慢性进展的神经退行性疾病。NIID的临床表现具有高度异质性，主要包括锥体系和锥体外系症状、小脑性共济失调、痴呆、痫性发作、周围神经病和自主神经功能障碍等。该病诊断困难，易漏诊和误诊，自１９６８年首次报道以来，至今全球仅报道数百例。以往该病的确诊需要通过尸检，目前通过皮肤活检可确诊，但致病机制尚不明确。近日，日本名古屋大学的研究团队于bioRxiv上发表了一篇利用长读长测序研究NIID的致病机制的文章“Long-read sequencing identifies GGC repeat expansion in human-specific NOTCH2NLC associated with neuronal intranuclear inclusion disease”，揭示了NIID的致病机制与NOTCH2NLC基因中GGC重复扩张有关，再次证实了长读长测序用于短串联重复序列（Short Tandem Repeats, STRs）扩张疾病研究的独特优势。 临床诊断 本研究选取了9个NIID家系（Fig1）和39个散发病例，其中家系1、2的NIID患者表现为运动感觉和自主神经病变，家系4、7、8、9、10、D的NIID患者表现为痴呆，家系3的NIID患者同时表现为神经病变和痴呆症状。在家系1、家系2和1例散发病例的尸检中，在中枢神经系统、周围神经系统和内脏器官细胞中均发现嗜酸性粒细胞、抗泛素和抗p62阳性的核内包涵体(Fig2)，这些临床表现是NIID诊断的基础。对其余的研究对象进行了皮肤活检检测，也均符合NIID诊断要求。 Fig1.家系图 Fig2.部分患者病理学特征和头颅MRI 二代测序未发现致病位点 研究人员首先对家系1中的患病个体和正常个体进行了二代全基因组测序（WGS）或全外显子组测序（WES），并通过连锁分析将致病位点定位在1p36.31-p36.22 (chr 1: 6218354-9719813 [maximum LOD 2.32])约3.5-Mb 区域和1p22.1-q21.3 (chr 1: 94670784-152323132 [maximum LOD 4.21])约58.1-Mb区域内，但在二代WGS和WES测序数据中并没有发现致病性的SNPs或CNVs。 Fig3.a.连锁分析结果图；b.NOTCH2NLC示意图； 长读长测序鉴定到GGC重复扩张 随后研究人员利用三代测序平台对来自8个家庭的13个患者和4例正常个体进行了全基因组测序，其中，除“F1-6”患者用PacBio RSII平台检测外，其余个体均用Oxford Nanopore PromethION平台进行检测。测序结果表明，13个患者在chr1:149390802-149390842处都有GGC重复扩增，该扩增序列位于NOTCH2NLC基因(NM_001364012)的5’UTR区域，定位在58.1-Mb的连锁区域内。对重复扩增区域进行进一步分析发现，除GGC重复单元外，重复序列中可能还包含GGA重复单元，这是由于在家系1、2和3患者的测序数据中都有reads支持GGA重复单元的存在，且F1-6的PacBio reads中也存在GGA重复单元。 Fig4.长读长测序数据分析结果 NOTCH2NLC位于1q21.1，是人类特有的三个NOTCH2NL基因（NOTCH2NLA、NOTCH2NLB和NOTCH2NLC）之一，在包括神经胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞在内的多种神经细胞中高度表达，被认为参与了人类大脑皮层的进化。NOTCH2NL基因间具有高度的序列相似性，且多为GC-rich区域，因此难以用二代测序发等方法进行分析。而长读长测序技术，对于分析此类同源和重复区域具有很大优势。本研究还发现利用Nanopore PromethION 平台对NIID患者进行全基因组测序，即使在低覆盖度（～8X）下，也能检测到NOTCH2NLC基因中的重复扩张序列。 研究人员还利用Nanopore测序数据还分析了GGC重复扩张序列的甲基化水平，发现NOTCH2NLC的甲基化水平在GGC重复扩增区域与未扩增区域之间并无差异。因此认为由GGC扩增导致的CpG甲基化导致NOTCH2NLC功能丧失的可能性较小。 RP-PCR进行结果验证 研究人员利用重复引物PCR技术(RP-PCR)对其余未经三代全基因组测序的患病和正常个体进行了重复扩张序列的分析。结果显示，所有NIID患者均存在（GGC)n重复扩增序列，而在未患病的家系成员和200例正常对照中没有。 Fig5.RP-PCR结果图（F1-3为正常个体，F1-6为患者） 研究结论 本研究检测到的NIID的三核苷酸重复序列扩张和核内包涵体特征与脆性X染色体相关震颤/共济失调综合征（FXTAS）相似。FMR1基因5’UTR区GGC重复数目为55-200个可导致FXTAS，患者的临床表现为震颤、共济失调和认知功能障碍，并且在神经系统细胞和体细胞中均可广泛观察到核内包涵体。目前，关于FXTAS致病机制有两种假说，一种是三核苷酸重复异常的RNA可与多个GGC RNA结合蛋白相互作用，导致其功能丧失；另一种假说是异常RNA可通过non-AUG进行翻译或非标准起始密码子起始翻译产生毒性蛋白，如多聚甘氨酸。本研究研究人员认为这两种假设也可能与NIID的发病机制有关，但还需要进一步研究。
本研究最终利用长读长测序解析了NIID三核苷酸重复序列特异性扩增的致病机制，促进了NIID致病机制的研究，拓展了NIID的诊断思路。同时，也为解决其它难以诊断疾病的研究提供了方法。
北京希望组作为三代测序精准医疗公司，一直致力于三代测序技术医学应用的研发与推广，在利用三代测序技术研究短串联重复序列扩张疾病方面积累了丰富的经验。于2017年7月在Genome Medicine杂志发表题为“Interrogating the‘unsequenceable’genomic trinucleotide repeat disorders by long-read sequencing”的文章，发布了一种称为RepeatHMM的新型算法，专门针对第三代长读长测序技术，不仅能准确识别重复序列区域，同时对重复序列单元进行准确计数，可帮助研究人员更深入揭秘串联重复疾病的致病分子机制。同时，于2018年9月与唐北沙教授团队合作在Journal of Medical Genetics杂志发表了题为“Long-read sequencing identified intronic repeat expansions in SAMD12 from Chinese pedigrees affected with Familial Cortical Myoclonic Tremor with Epilepsy”的文章，利用三代长读长测序技术成功解析了中国人群FCMTE致病机制为SAMD12基因内含子区“TTTCA/TTTTA”五核苷酸重复序列高度异常扩展。 更多关于文章或三代测序技术医学应用的详情，可致电400-651-6230/132-4093-5657 参考文献： Sone J, Mitsuhashi S, Fujita A . et al. Long-read sequencing identifies GGC repeat expansion inhuman-specific NOTCH2NLC associated with neuronalintranuclear inclusion disease.bioRxiv preprint first posted online Jan. 9, 2019; doi: http://dx./10.1101/515635. |
|
|
