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文章题目：Molecular mechanisms underlying alcohol-drinking behaviours 研究人员：美国加利福尼亚大学和以色列特拉维夫大学 发表时间：2016. 07 期刊名称：Nature Reviews Nephrology 研究亮点 酒精使用障碍特征是不顾后果大量饮酒。从适度到过度到不受控制的过度饮酒的过渡，是由于神经性适应导致的异常动机学习和记忆的过程。本研究中，研究者对啮齿动物进行了分子结合和行为方法研究，阐明了控制酒精摄入量的分子机制，也就是“阻止途径”，以及从中度到不受控制的神经适应的过度转变，称之为“启动路径”。研究者还讨论了两种途径的转录后遗传和表观的变化。 研究背景 根据世界卫生组织统计，10-16%的15岁或以上反复过度饮酒者被称为“问题饮酒者”，这些人中许多患有轻度或中度的酒精使用障碍（AUD），尽管知道酒精摄入的不良影响，但是仍然控制不住对酒精的渴求。问题饮酒者有相当一部分有严重的AUD，他们极其依赖酒精，通常表现出强迫性饮酒并失去控制行为，戒酒后有明显的受戒表现，包括焦虑、抑郁、社交减退、睡眠、恶心和癫痫发作，这些都是致命的。使用动物模型研究表明酒精和其他滥用药物一样，是激活了中脑皮质系统内的分子级联，最终加强了药物奖励机制。随着时间推移，部分中脑皮质边缘和黑质纹状体通路的异常激活，可能导致中度到过度饮酒的过渡。这种变化与烦躁不安和消极的强化机制有关，被认为是长期分子神经适应的结果。 在本文中研究者通过啮齿动物模拟人类饮酒的模式来研究促进或预防酒精摄入以及滥用的分子信号传导机制:适度饮酒、过度饮酒、依赖性、渴望和复发性。研究者将有助于从中度饮酒到不受控制的过量饮酒并过渡到酒精依赖的通路称之为“启动通路”，将内源性与启动通路相反的通路称之为“终止通路”，由于成瘾是学习和记忆的不良适应形势，研究者主要关注与突触可塑性、学习和记忆有关的通路分子。 研究过程 GO通路促进过度饮酒 Figure1描述了如何启动中脑皮质边缘和黑质纹状体区域内的细胞内信号级联，并最终产生饮酒行为的适应性。 Figure1 Signalling pathways underlying the gopathways 1. PKA 环AMP依赖性蛋白激酶A（PKA）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在学习和记忆以及滥用药物的行为反应上发挥核心作用，其实PKA也是许多酒精行为的关键发起者。PKA由腺苷酸环化酶激活，其本身是由Gsα蛋白欧联受体刺激激活，通过减少Gsα表达或者删除编码AC1和AC8的近对PKA进行全面的活性抑制，从而降低适度饮酒的小鼠模型中的酒精摄入量。这些研究表明PKA在酒精摄入机制中具有重要促进作用，抑制机制是通过抑制ENT1来激活PKA来完成的，后者控制腺苷的细胞外水平。此外腺苷还与A2AR结合，与Gsα和PKA偶联，A2ARs的抑制性降低了中度饮酒小鼠中的饮酒量。酒精诱导激活的PKA导致了其底物的磷酸化，包括FYN激酶抑制剂，这些抑制剂富含纹状体蛋白质-络氨酸磷酸酶和RAS特异性鸟嘌呤核苷酸释放因子1。 络氨酸蛋白激酶FYN在突触可塑性、学习和记忆中具有重要作用，FYN的活性受STEP的负调控，其使磷酸化并因此抑制激酶。STEPA的活性受PKA的负调控，PKA酸化磷酸酶从而抑制其催化活性。在小鼠模型中过量饮酒导致了PKA介导的STEP的磷酸化，由于酒精抑制STEP活性，在高水平酒精摄入的啮齿动物的DMS中检测到了强烈且持续的FYN的活化，酒精介导的STEP抑制也能激活蛋白络氨酸磷酸酶-α（PTPα），这是激活FYN所必需的。实际上过量饮酒会增加FYN和PTPα之间的相互作用，从而促进激酶的持续活化。有趣的是酒精诱导的STEP抑制和FYN以及PTPα的活化可以在DMS中检测到，但是在其他纹状体区域（背外侧纹状体DLS和NAc）没有检测到，证明酒精摄入引起的分子变化具有高度选择性。酒精介导的FYN活化引起NMDA型谷氨酸受体的磷酸化，其反过来在DMS中产生稳定持久的NMDAR活化。NMDAR中的钙可以激活钙-钙蛋白依赖性蛋白酶II型（CaMKII），小鼠模型中中度饮酒会增加CaMKII的活性，长期增强突触可塑性的细胞依赖于NMDAR和CaMKII型谷氨酸受体（AMPAR）向突触膜的运输。在高水平酒精摄入的小鼠DMS中检测到GluN2B以及AMPAR亚基的运输增强。此外反复酗酒和戒酒循环的小鼠模型中AMPAR活性增强并在DMS神经元中产生结构的改变。实验证明CeA中CaMKII或AMPARs的抑制减少了酒精的摄入，STEP在DMS中的敲除会增加中度或过度小鼠模型中的酒精摄入量。 突触可塑性和记忆过程的另一个重要因素的HRAS，过量饮酒和戒酒的大树模型中显示HRAS活化，并且在NAc下调HRAS的表达通过抑制其活性减弱了过量饮酒大鼠模型中的自我给药，此外小鼠模型中编码RAS GTP酶的KRAS43杂合基因的敲除未检测到酒精摄入量的升高，Rasgrf2的缺失会增加适度酒精摄入小鼠模型中的摄量。NAc中PI3K或者AKT的局灶性抑制或Crmp2 mRNA水平的下调大量减少了啮齿动物的过量饮酒。雷帕霉素复合物1（mTORC1）是一种负责属兔蛋白翻译、突触可塑性、记忆和成瘾过程的起动激酶，其在高水平酒精摄入下激活，在小鼠模型中，单次过量饮酒足以激活高信号传导过程。最后在具有饮酒过量史的大鼠模型中可以检测到酒精相关记忆，激活mTORC1导致其内侧前额也皮层中突出蛋白的合成增加，这表明这些区域中mTORC1在酒精相关记忆重建中具有相关作用。总之，这些发现表明PIK3-AKT-mTORC1在神经适应中的作用，作用于饮酒和复发的相关过程。 PKCε在GO途径中具有良好的记录作用，敲除该基因后小鼠模型可以摄入更少的酒精，并且对酒精的偏好有所减弱。PKCε的作用位点是NAc和amygdala，其中杏仁核是应激和负强化的焦点区域，在小鼠模型中造成焦虑行为。在PKCε敲除的小鼠中检测到CRF诱导的A性GABA受体依赖性和抑制性突触电位增强趋势的减弱，这些研究表明PKCε在压力和酒精摄入量增加之间其中介作用。 HRAS下游的另一种激酶是丝裂原活化蛋白激酶1（MEK1），其激活细胞外信号调节激酶1和2（ERK1和ERK2）。ERK1和ERK2在学习、记忆和成瘾方面具有明确的作用。但是ERK1和ERK2信号转导主要与STOP通路相关。 研究者描述了可以保持酒精摄入水平适中，控制酒精摄入的分子适应过程，Stop通路，该通路揭示了为什么有些人会成为问题饮酒者并具有AUD症状，而有些人却没有。 Figure 2 Signallingpathways underlying the stop pathways 脑源性神经营养因子（BDNF）在中枢神经系统发育、可塑性、学习和记忆中起重要作用，而神经胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）对神经元多巴胺的功能起重要作用。Bdnf和Gdnf都是参与酒精反应中的基因，在中度酒精摄入的啮齿动物中增加饮酒量后Bdnf和Gdnf转录物水平增高，在少量酒精摄入的小鼠模型中Bdnf杂合小鼠以及敲除Bdnf的小鼠要比野生型同窝小鼠可以消耗更多的酒精，小鼠中BNDF水平的增加减少了酒精摄入。为了论证BDNF阻断酒精摄入，在DLS中BDNF的敲除导致啮齿动物摄入酒精的增加，mPFC中BNDF的过表达或者全身给予BDNF相关蛋白激酶激动剂可以使小鼠的酒精摄入正常化。GDNF在饮酒中的作用和BDNF相当，短发夹RNA介导的VTA或者GNDF的敲除加速了小鼠的过量饮酒，并加重戒酒后复发强度。将GDNF输入到小鼠的VTA中可以减少酒精的过量摄入，并可以阻止戒酒后复发。总之研究结果表明酒精诱导的BDNF和GDNF的上调可以起到控制酒精摄入的作用。GDNF通过使VTA中多巴胺神经元的不能正常发作以及NAc中低水平的多巴胺来减少酒精摄入。长期过量饮酒会降低小鼠mPFC中BDNF的表达进而减少了其可控制依赖性调控能力，这和人群研究相符合，研究表明在酒精依赖型人血样本中的BDNF和GDNF的水平均有降低。 这些保护型稳态通路的发现也提出了一个问题，即为什么有人成为问题饮酒者并表现出AUD表型，而大多数人没有。一种可能性是特定生长因子水平的固有差异导致不同的饮酒水平；另一种可能是Stop路径相关基因的功能丧失或者突变增加了AUD的易感性和强度，其实，BDNF中的功能丧失突变可能会导致过度饮酒的遗传风险。具体而言，BDNF中可明确描述的功能丧失突变是G196A（rs6265）发生氨基酸雀带（Val66Met），从而导致BDNF100的活性减小。人类研究表明Val66Met多态性和早期酒精中毒发病相关、具有复发风险高相关。 小鼠DLS和VTA中的BNF和GDNF通过ERK1/2信号转导控制饮酒水平，ERK1/2上游抑制剂的激活会增加小鼠的酒精摄入量，这表明酒精诱导的ERK1/2激活是控制酒精摄入必需的过程。 昼夜节律基因又称时钟基因，是允许生物体精准适应外部和内部环境，同时也是酒精介导行为的潜在参与者，特别是Stop通路中。时钟基因Per1（编码PERIOD1）的突变导致小鼠在失败社交后饮酒量增加，编码非功能性蛋白质的Per2突变的小鼠表现出高水平酒精摄入和饮酒动机的增加。在人类中PER1和PER2的单点突变与重度饮酒相关，使年轻人的压力敏感性增加。负责PER2蛋白酶体降解的蛋白激酶的量降低时大鼠的酒精消耗也随之降低。 PKA是GO通路的核心参与者也在Stop通路中起关键作用，例如Adcy5（编AC5）基因的敲除增加了啮齿动物的酒精摄入，编码PKA RII调节亚基的基因缺失已知PKA的活性从而增加小鼠的酒精摄入。PKA-CERB在焦虑和酒精摄入增加中具有守门员的独特作用，Creb杂合子的小鼠摄入更多的酒精，相比于同窝野生型的更喜欢摄入酒精。PKA在CeA中抑制降低了磷酸化CEB的水平，并且与焦虑和酒精摄入水平增加相关，PKA在CeA中的活化会产生相反作用。这表明焦虑和AUD易感性增加可能归因于PKA的先天性差异，特别是在杏仁核中，PKA的活化才能产生酒精摄入的神经抑制行为。 研究结果和相关问题 本研究给出了几个比较有趣的观点，首先，酒精摄入引起大脑区域的特异性反应，通过阻止或者促进神经元的特异性神经适应来影响酒精的摄入；其次酒精诱导的细胞内信号转导的激活或者抑制取决于酒精摄入量和暴露的持续时间；最后，相同的信号分子（例如PKA和ERK1/2）对GO和Stop通路都有贡献作用，其分子的互反结果是由活性基因座决定的。 尽管酒精似乎是依靠改变分子级联反应来产生依赖性，但是目前还不清楚详细的作用机制，一种可能性酒精和其他滥用药物一样，通过和有限数量的结合伴侣发生反应然后引发细胞内事件，目前也已经找鉴定出了几种与酒精直接相互作用的通路，但是这些相互作用不能解释酒精对转导信号的所有或者大部分的作用机制。另一种可能性是酒精改变了细胞膜的结构，特别是脂筏的组成，在GO通路中酒精可以很容易的渗透到膜脂，研究还发现酒精可以改变膜的流动性和胆固醇含量，胆固醇含量因大脑区域而异，因此酒精可能通过改变膜结构、流动性和组成，在大脑区域进行特异性信号转导。 还有一个问题，酒精如何同时改变这么多基因的表达和水平或者活性的？本研究描述的许多信号级联反应可潜在的激活基因早期的转录，包括转录因子的FOS家族，实际上在啮齿动物的酒精摄入或戒断时，许多脑区域的FOS免疫反应会增加，FOS通常用作神经元激活的标记物，但是FOS活化的下游结果却研究的很少，尽管近年来已经进行了大规模的人类基因组和表观基因组学研究，但是还是需要进一步研究确定这些基因是全部还是一部分作用于AUD的发生发展。与AUD相关的遗传基因座的鉴定由于其复杂性一直有很大的挑战性，最近研究结合动物和人类的研究推动了这一领域的发展，确定了信号中新基因的突变，这些突变可能有助于了解这些疾病的先天易感性差异。 Go和Stop通路是由不同的信号转导和区域路径组成，这些通路不一定相互依赖，Go通路中每个不同组分的正常功能对于维持饮酒行为是足够的但不是必需的，此外，相同的信号转导途径可能在AUD的不同阶段和表型中具有不同的作用，这个结论为治疗AUD带来了信息网，因为靶向单分子具有足够的功效来减少饮酒行为。美国FDA批准的一些作用于信号转导的药物可能适用于治疗AUD，比如卡麦角林通过上调VTA194中的GDNF来抑制过量饮酒和戒酒复发，雷帕霉素也可以减少酒精摄入和戒酒复发性，第二代Mtorc1抑制剂195的快速发展也为治疗AUD提供了新的治疗方法。最后，靶向控制表观遗传修饰的酶可能是另一种药物治疗策略，因为它可能足以抑制中枢产生所需的行为改变，例如HDAC抑制剂SAHA，在啮齿动物模型是有效的饮酒抑制剂。因此，阐明酒精摄入的分子机制是治疗AUD的有效方法。 小编评论 生活中总能遇到嗜酒如命的人，这样的群体也有苦衷，或许由于生活压力，或许由于体内藏着的那些“嗜酒基因”，对于嗜酒和反复戒酒都不成功的人群，也许应该考虑一下基因层面的作用，或许解码了这些促进酒精成瘾相关的基因突变，可以进行更有效的靶向治疗。 参考文献： [1] Dorit Ron and Segev Barak. Molecular mechanisms underlying alcohol-drinking behaviours[J]. Nature Reviews Neuroscience 2016, volume17, pages 576–591 |
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