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本期iProteome为大家带来了Jeroen 课题组近期发表在Cell上的 The Human RNA-Binding Proteome and Its Dynamics during Translational Arrest一文。 细胞中蛋白质和RNA以复杂的方式相互作用，参与多种生物过程。RNA大体可以分为三类：mRNA(信使RNA)、rRNA(核糖体RNA) tRNA(转运RNA)。各类RNA在遗传信息流中起着核心作用。但目前研究蛋白质-RNA相互作用的方法仅限于表征某种特定蛋白质的相互作用（如交联免疫沉淀测序[CLIP-seq]），特定种类的RNA（如RAP、CHIRP），因为这些方法依赖于RNA 多聚腺苷酸化，忽略了> 95％的非聚腺苷酸化的哺乳动物细胞RNA。这包括高丰度的“管家”RNA，如tRNA，rRNA，snRNA和snoRNA以及其他多种非编码RNA（ncRNA）。  本文开发了一种用于提取和纯化交联的蛋白质-RNA的方法——XRNAX，可以纯化各种RNA类型。并且，此方法XRNAX将蛋白质交联的RNA纯化为物理实体，可以作为各种下游应用的通用起点，比如测序和质谱（MS）。具体方法如下： 紫外交联细胞，用TRIZOL提取RNA时，收集TRIZOL中间层，洗涤去除游离蛋白和RNA，DNA酶消化以消除DNA，得到含有高浓度RNA（> 1,000 ng / mL）和蛋白质（> 0.7 mg的提取物）/ mL）的提取物。且实验结果表明DNA 含量<0.1% (weight DNA/weight RNA)。 接着，本文用蛋白酶K消化从MCF7细胞获得的XRNAX提取物，测序其RNA。为了比较，使用常规TRIZOL方案对从非交联的MCF7细胞中提取的总RNA进行测序。另外，在耗尽rRNA之前和之后对RNA进行测序以显示提取物的相对成分。结果表明XRNAX提取物含有在经典TRIZOL提取的RNA中也检测到的所有主要RNA类型。在几乎相同的测序深度下， XRNAX制备的中等丰度和低丰度转录物具有更好的覆盖率，检测到在XRNAX衍生的文库中观察到的6,306个转录物，包括1,500种蛋白质编码和1,500种大型基因间区非编码RNA（lincRNA）。 接下来使用MS分析XRNAX提取物的蛋白质组成，文章比较了XRNAX提取物与MCF7细胞的总裂解物的蛋白质组成。证实XRNAX提取物更多地富集RNA结合蛋白。为了证明是直接蛋白质-RNA相互作用而非特异性或间接蛋白质 - 蛋白质作用，本文在细胞培养中应用稳定同位素标记（SILAC）。首先，将重的SILAC MCF7细胞进行UV交联并与非交联的轻SILAC细胞组合，进行XRNAX并通过MS分析提取物的蛋白质含量。许多仅在重SILAC通道中显示强度的肽，表明RNA交联肽的富集。然而，文章注意到许多非富集的肽段来源于真正的RNA结合蛋白，这表明即使没有交联的蛋白也被困在 TRIZOL中间层。基于此，文章设计了一种基于变性二氧化硅的清理方法，二氧化硅柱在标准条件下保留了RNA而不是蛋白质交联的RNA，将XRNAX提取物进行了有限的胰蛋白酶消化，从而有效地保留了与蛋白质片段交联的RNA。二氧化硅富集后，RNA交联蛋白富集由69％变为89％。 本文将XRNAX与蛋白质组学相结合，应用于三个人源细胞系，MCF7，HeLa和HEK293，以得到人类RNA结合蛋白质组的整合网络图。RNA结合蛋白质组的表征证实了之前显示的大多数蛋白质与poly（A）RNA相互作用。除此之外，本文还鉴定了数百种非poly（A）相互作用物的蛋白质，其中许多蛋白质以前从未报道过与RNA相互作用。这包括一组溴结构域蛋白（据报道可结合eRNA），扩展了已知与ncRNA（例如PRC2，CoREST或SMCX）相互作用的染色质修饰复合物的集合，并强化了ncRNA可能发挥更广泛作用的观点。此外，文章发现poly（A）结合蛋白包含更多特定的低复杂度motif，通过液滴形成了自我聚集。特别是，许多带有IDR的poly（A）结合蛋白，如TIA，hnRNPA2或FUS，与mRNA成核有关（如应激颗粒（stress granules,SG））。 随后，文章用亚砷酸盐处理，探究蛋白质翻译受阻时的变化情况。亚砷酸盐诱导产生的翻译减少在10分钟后已经明显，30分钟后趋于平稳。对于大多数蛋白质，总的蛋白质表达水平没有改变，然而，一个明显的蛋白质群显示出丰度逐渐降低。GO分析表明，在亚砷酸盐处理5min后，下调的蛋白质与翻译相关。进一步研究发现，下调的为胞质核蛋白体，而非线粒体核蛋白体。Western blot结果确证亚砷酸盐处理后自噬增加。用自噬抑制剂spautin-1预处理后，亚砷酸盐处理产生的蛋白水平下调减轻。SILAC标记的MCF7经亚砷酸盐刺激，利用XRNAX、二氧化硅富集和MS分析，定量了765种蛋白质。尽管大多数蛋白质未变化，但有些蛋白质与RNA的结合显著降低，唯一增加超过2倍的蛋白质是TP53BP1。该数据集与总蛋白质组的数据比较结果显示，蛋白质TP53BP1和EXOSC2 与RNA结合的增加可以完全归因于它们与RNA的关系。RNA结合大量减少，相应蛋白丰度也降低。然而，与RNA结合的减少相比，这种程度的降低较小，表明主要源于RNA的释放。有趣的是，这一现象的发生与核糖体蛋白RPS28、RPS14和RPS3相关。几乎所有检测到的EIF蛋白丰度降低40%-50%，而RNA结合无显著变化。 最后，本文结合CLIP-seq来验证蛋白质组学数据。XRNAX 提取物经超声破碎后，用eCLIP免疫沉淀LMNB1。RNA测序鉴定了各种ncRNA，主要是snoRNA显著富集。另外本文发现成熟5.8S转录本的30段的富集非常显著，这是已知的5.8S rRNA成熟过程中外源体降解的主要区域。该结果表明EXOSC2在亚砷酸盐作用下被导入细胞核，以促进rRNA的成熟。 本文提出的XRNAX的方法，可以对不同种类的RNA交联蛋白进行纯化分析，并且文章使用大量实验对比证明此方法的可行性和可靠性。利用此方法鉴定了三种细胞系的人RNA结合蛋白质组，发现了700多个非poly(A)互作蛋白。并用亚砷酸盐刺激，鉴定到翻译受阻时蛋白的动态变化。 作者：张海珠 |
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