慢性乙型病毒性肝炎影响着全球超过 2.5 亿人口,每年约有 65 万人死于 HBV 相关终末期肝病。共价闭合环状(ccc)DNA 是慢性乙肝持续感染的元凶,作为病毒复制的中介,其在宿主肝细胞核内以微染色体的形式存在,目前的治疗手段难以将其彻底清除,从而达到慢性乙肝的彻底治愈。 Gut 杂志上发表了德国弗莱堡大学医院 Nassal 教授的一篇综述,该文概述了 cccDNA 的研究历史、目前研究中存在的困难、近期的研究进展以及与之相关的治疗策略。 人 HBV 是嗜肝 DNA 病毒的原型,同属哺乳动物的正嗜肝 DNA 病毒还有旱獭肝炎病毒(WHV)、地松鼠肝炎病毒(GSHV)、毛猴乙型肝炎病毒(WMHBV)等,此外还有水禽类嗜肝 DNA 病毒,如鸭乙型肝炎病毒(DHBV)、鹭乙型肝炎病毒(HHBV)。 01 HBV 的结构特征 如图 1A 所示,HBV 病毒,或称「Dane 颗粒」,由含有 3 种外膜蛋白(血清学上的 HBsAg)的包膜包裹核衣壳(血清学上的 HBcAg)构成。核衣壳内包含的病毒基因组是一个部分双链的松弛环状 DNA,即 RC-DNA。HBV 基因组最显著的特征在于其结构紧密,功能齐全(图 1B)。HBV 基因组的开放阅读框(ORF)存在重合,一个 ORF 可转录 2 种 mRNA,编码 2 种蛋白,所有基因表达和复制所必须的调节原件都埋在基因序列中。 图1. HBV 的基本分子特征。 02 HBV 的感染与复制 如图 2 所示,HBV 感染肝细胞始于病毒颗粒表面 L 蛋白被肝细胞表面钠 - 牛磺胆酸共转运多肽(NTCP)受体识别并结合,可能以内吞形式进入细胞。在胞浆中释放出核衣壳,核衣壳在核心蛋白核定位信号的作用下,进入胞核,并释放出 RC-DNA,并最终形成 cccDNA。 图2. 肝细胞中HBV的生命周期 01 宿主特异性的限制 由上述 HBV 感染的生命周期可见,cccDNA 是 HBV 在肝内进行复制的模板,是建立有效感染的基础。然而,由于 HBV 的宿主范围极窄,目前仅有少量、复杂的体外感染系统可用于研究 cccDNA。 02 NTCP 受体发现带来的希望 NTCP 作为 HBV 受体这一发现为 cccDNA 的研究提供了极大便利,通过表达 NTCP 受体,实验中常用的 HepG2、Hu7 等细胞系均可被HBV 感染,但要获得高感染率仍需在培养体系中加入相当高剂量的病毒颗粒(细胞数量的 10E4 倍)来实现。 03 非感染模型难以形成 cccDNA 研究 HBV 的非感染模型,向细胞转染 HBV 质粒或尾静脉高压注射 HBV 质粒等,cccDNA 形成均很少甚至没有。在这些模型中,质粒替代cccDNA 成为病毒复制的主要模板。与之类似的还有 HBV 转基因小鼠,其 HBV 基因是整合在小鼠基因组中的。 04 鸭肝病毒模型对 cccDNA 的研究贡献 不同于 HBV,DHBV 在不同的体系中很容易检测到 cccDNA,而鸭肝细胞也相对容易获得,体内试验较为便利。 01 Southern blot 检测敏感性有限 由于 cccDNA 呈超螺旋结构,相比与同等长度的 RC-DNA,其具有更高的电泳迁移率,因此 cccDNA 可通过 Southern blot 与其他形式的肝病毒基因组进行鉴别。 图3. Southern blot 检测 cccDNA 慢性感染鸭肝炎模型显示单个细胞内平均含有 10 拷贝左右的 cccDNA,不同细胞间拷贝数变化很大,且随着感染的病程具有时间上的波动。 02 其他检测方法难以排除 RC-DNA 的干扰 所有基于 PCR 的检测方法,如引物设计在 RC-DNA 正链缺失段两端的「over-gap」PCR,或以环状 DNA 为模板的滚环扩增,但不能绝对排除 RC-DNA 的干扰。另有非 PCR 的侵入分析技术,利用一条引物与 cccDNA 形成 3 链结构,这一结构可被特异性的核酸内切酶识别。 01 宿主DNA修复系统参与cccDNA的从头合成 侵入肝细胞的 RC-DNA 是 cccDNA 形成的直接前体,由 RC-DNA 形成 cccDNA 称为「从头合成」,这一过程需要去除负链 5』端的末端 P 蛋白和 3』端的末端过剩段(r),两端连接成环,同时正链的 5』端去除 RNA 引物,3』进行延长,两端闭合。 图4. RC-DNA 的结构特征 02 cccDNA的确切生命周期尚不清楚 核苷类药物停药或免疫抑制状态下病毒反弹提示 cccDNA 可持续存在长达数十年,但目前尚没有人类 cccDNA 消减动力学数据。土拨鼠和鸭肝感染模型提示 cccDNA 的半衰期为 33 和 57 天。黑猩猩急性感染时,cccDNA 半衰期缩短至 3 天,但仍有痕量 cccDNA 可持续数年。
以 cccDNA 作为治疗靶点,首先需要阐明 cccDNA 的生命周期取决于单个分子的生命期还是通过更新维持 cccDNA 池。若没有 cccDNA 的更新,那么阻断 RC-DNA 向 cccDNA 转变仅在感染之初有效。 01 阻断 NTCP 受体 在人源化小鼠模型上,低剂量 HBV 感染后予以 NTCP 受体阻断剂 Myrcludex B 治疗,不仅可以阻止病毒播散,还可使已感染细胞 RC-DNA 向 cccDNA 的转变过程受损。这一结果上需要在临床研究中加以确认。 02 靶向 DNA 修复系统 第二个可能的靶点是宿主 DNA 修复系统。然而,宿主 DNA 修复系统繁杂庞大,且存在代偿机制,阻断其中某条通络或并不能阻断 cccDNA 的形成,而大范围阻断将影响到细胞本身的 DNA 修复。 03 阻断 RC-DNA 入核 另一个替代策略是阻断 RC-DNA 前体入核,RC-DNA 的核转运依赖于核衣壳,靶向核衣壳的药物正在研发当中。 04 诱导核衣壳在胞浆分解 诱导组装空的核衣壳或不规则的聚合物,将破坏核衣壳的稳定性,它们或在胞浆中解体,RC-DNA 释入胞浆,不仅无法达到胞核,反被胞浆 DNA 感受器识别,诱导 1 型干扰素的产生。 05 功能性失活 cccDNA cccDNA 的转录受到外部调控,靶向这些细胞调控机制或达到 cccDNA 功能性失活。这类选择包括干扰素α、靶向 HBx 的药物,以及 DNA 损伤结合蛋白 DDB1。 06 直接清除已有 cccDNA 肝细胞内 cccDNA 池的稳态取决于 cccDNA 消长的速度。由于 cccDNA 更新动力学尚不明确,清除已有的 cccDNA 似乎是更加直截了当的选择。在慢性感染条件下,清除已有 cccDNA 有两种策略,一是免疫介导的 cccDNA 的清除,二是设计核酸酶对基因进行编辑。 ⑴ 免疫清除 天然免疫和适应性免疫在清除急性 HBV 感染时发挥重要作用,慢性 HBV 感染存在免疫应答的不足,重新建立有效的免疫应答意义重大。 ⑵ 基因编辑 在不同免疫介导的 cccDNA 下降过程中,一部分 cccDNA 似乎相当顽固,难以进一步降低。这或许是含有 cccDNA 细胞本身的特质,也有可能是 cccDNA 存在更难以被分解的形式,例如甲基化、染色体化等。 图5. 靶向 cccDNA 的潜在治疗策略 cccDNA 在 HBV 持续感染中的作用毋庸置疑,治愈慢性乙肝将必须攻克这一难题。 最后,小编要隆重登场了: 噔噔蹬等! 我就是小码哥, 小码哥就是我↓ 如果你对基因相关话题感兴趣 或者对小码哥本人感兴趣 |
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