| 【摘要】：普洱茶为中国特色的传统发酵茶，历史悠久。普洱茶发酵过程中的微生物对其品质的形成有着重要的贡献。普洱茶独特的品质风味是经过其茶叶本身与其发酵过程中的微生物共同作用的结果。不同普洱茶产区所产出的成品茶其品质风味各有特色，然而各产区选用的原料茶的品种并无较大差异，所以为了研究这些差异产生的原因，我们对普洱茶发酵微生物进行了溯源分析研究，重点研究普洱茶原料茶生长环境中的空气微生物、茶叶内生菌以及发酵车间中的环境微生物。本文采用传统培养和分子生物学相结合的研究方法对云南省普洱茶树良种场的三个茶山的空气微生物、茶山上茶树叶片内生菌以及发酵车间中的环境微生物进行了采集、分离纯化与鉴定和微生物群落分析，研究结果显示普洱茶渥堆发酵过程中的微生物有一部分是来自于茶叶生长环境中的空气微生物、茶叶内生菌和普洱茶发酵车间。本文的研究内容主要有以下几个部分： 1．对普洱茶生长环境的空气微生物进行了采集与鉴定，采用固体撞击法和滤膜过滤法。固体撞击法是利用安德森空气微生物采样器对云南普洱茶树良种场的三个茶山进行了空气微生物的采集，经培养后进行分子生物学鉴定。分三次取样，在24℃和45℃两个温度下培养，进行分离、纯化和鉴定。滤膜过滤法是用滤膜采样器将空气微生物采集到滤膜上，经过菌体洗脱、DNA提取、PCR扩增和高通量测序分析等步骤，初步确定该地区普洱茶生长环境中空气微生物的种类及各种类所占数量比例，为探究普洱茶发酵微生物的来源提供一定的数据支持。 2．对新鲜茶叶中的内生菌进行分离鉴定。采集新鲜健康的茶树叶片，在无菌条件下用组织粉碎机粉碎，涂布，培养，分离纯化，采用了与培养空气微生物相同的四种培养基，最后经分子生物学研究方法鉴定出9种微生物，其中在空气微生物中出现的有4种，分别是：禾谷镰刀菌Fusarium asiaticum和Wickerhamomyces anomalus、 Bacteroidetesbacterium、树枝状孢菌Cladosporium cladosporioides。 3．采集、分离并鉴定普洱茶发酵环境中的微生物。车间中环境微生物的来源主要有三个方面：车间空气、地面、发酵用水。在普洱茶渥堆发酵前的车间进行取样，采用LB和YEPD两种培养基，在不同温度（25℃、37℃、45℃、55℃）恒温下培养2-3天，对微生物进行培养、分离、纯化及保存，并将纯化后的微生物菌落进行PCR反应，测序，确定微生物的种类。最终鉴定出12种微生物，其中有6种微生物在普洱茶渥堆发酵微生物中也有发现，分别是微小根毛霉Rhizomucor pusilus、埃默森篮状菌Talaromyces emersonii、塔宾曲霉Aspergillus tubingensis、疏棉嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosus、黑曲霉Aspergillus niger以及烟曲霉Aspergillus fumigatus。 4．对这三个来源的微生物进行综合分析，联系本课题组对普洱茶渥堆发酵过程中的微生物的研究成果，确定其发酵微生物有一部分来源于普洱茶生长环境中的空气微生物、茶叶内生菌以及发酵车间中的环境微生物，并且从普洱茶区空气微生物的群落结构可以分析得出，普洱地区是生产普洱茶的最佳地区之一。 |
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