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2.1 RNA甲基化修饰m6A调控造血干细胞定向分化 METTL3介导的m6A修饰在生物节律、DNA损伤应答、干细胞的自我更新和多能性调控、母源−合子转换、果蝇神经功能调节与性别决定、小鼠早期胚胎发育等真核生物的各种生物学过程和个体发育中发挥着非常重要的作用。RNA甲基修饰酶和结合蛋白及其参与RNA 代谢加工的发现，提示RNA甲基化修饰具有重要生物学功能。 脊椎动物中，造血干细胞最初由特化的生血内皮通过内皮−造血转化过程(EHT)产生于胚胎期主动脉−性腺−中肾区，随后向血组织迁移并进行扩增，向胸腺迁移发育为淋系细胞，最后向骨髓(小鼠和人)或肾髓(斑马鱼)迁移以维持终生造血。通过 m6A 抗体进行MeRIP-seq和m6A单碱基分辨率的 miCLIP-seq测序技术，绘制了斑马鱼胚胎发育的m6A修饰精细图谱，发现m6A通过特异性修饰内皮−造血转化过程中的关键基因notch1a，招募结合蛋白YTHDF2降解mRNA，抑制了Notch信号通路，使得内皮−造血转化过程有序发生，促进内皮细胞转化为造血干/祖细胞(HSPCs)。在mettl3缺陷的斑马鱼胚胎中，m6A修饰水平显著降低，notch1a无法正常降解使得Notch信号通路持续激活，最终导致内皮细胞无法正常转化为造血干/组细胞。此外，Mettl3 敲除小鼠胚胎中也表现出相似的表型。这些结果揭示mRNA m6A甲基化修饰在脊椎动物造血干细胞命运决定中的调控机制，阐释RNA的表观修饰在血液发育中的关键作用。 2.2 RNA 甲基化修饰m6A调控精子发生 由于Mettl3敲除会导致小鼠早期胚胎致死，Mettl3条件敲除介导的m6A修饰在哺乳动物体内组织发育中的生物学功能还不清楚。利用CRISPR/Cas9系统介导的同源重组技术和 Cre-loxP系统成功地建立了生殖细胞(Vasa-Cre)中特异性敲除Mettl3 的小鼠(Mettl3CKO)模型，并利用该模型系统地研究了METTL3介导的m6A修饰在小鼠精子发生过程中的重要作用和调控机制。通过 H&E(苏木素−伊红)染色、免疫荧光染色、核染色体铺片等研究表明，Mettl3敲除会抑制小鼠精原干细胞分化和减数分裂起始过程，最终导致雄性小鼠不育。通过 RNA-seq、m6AmiCLIP-seq和生物信息学分析发现，Mettl3 缺失会导致m6A水平下降，引起与精原干细胞维持和分化、细胞周期和减数分裂相关基因的RNA可变剪接异常和生殖细胞整体基因表达的紊乱，最终导致精子发生过程受阻，说明RNA甲基转移酶 METTL3介导的m6A修饰在哺乳动物小鼠精子发生过程中的重要生物学功能。 在小鼠生殖细胞中用Vasa-Cre特异性敲Mettl3或者Mettl14会导致m6A水平下降，引起精原干细胞增殖和分化相关基因转录物的翻译功能失调，精原干细胞逐渐耗尽；利用 Stra8-GFPCre同时敲除Mettl3和Mettl14，会破坏精子发生过程中单倍体特异性基因的翻译，最终导致精子形成受阻。而雄性m6A去甲基酶Alkbh5-/-小鼠也出现睾丸变小、生精异常、精子活力异常等表型；同时在发育至Ⅶ期的生精小管中检测到初级与次级精母细胞数量显著增加，粗线精母细胞与成熟精子的数量明显减少，同时伴有细胞凋亡。Ythdc2敲除小鼠也发生在精细胞减数分裂前期出现过度的细胞凋亡，从而导致睾丸变小及精子发育异常。YTHDC2的m6A结合能力及其3′→5′解旋酶活性对于维持精子发育过程中减数分裂相关基因的正确表达模式具有重要调控功能。上述研究提示RNA m6A甲基化修饰的动态平衡是配子(精子)发育过程中重要的调控因素。
m6A修饰在神经系统的发育以及功能的行使中也发挥不可替代的调控作用。m6A RNA甲基化修饰在中枢神经系统的发育以及功能行使中发挥重要的调控作用。敲除Ime4基因的果蝇可以出生并存活，但果蝇寿命变短，并表现出明显的行为异常，提示m6A修饰的缺失影响果蝇神经系统功能。在小鼠的中枢神经系统中特异地敲除Mettl14基因会严重影响小鼠大脑皮质的发育。小鼠中Ythdf2基因缺失导致m6A整体水平升高，使得参与神经干细胞分化和神经元轴树突形成的重要因子无法正常进入RNA降解途径，从而导致大脑皮层神经干细胞不能正常地进行不对称分裂，造成神经前体细胞的大量缺失、严重影响神经元的分化，致使小鼠的前脑大脑皮层发育缓慢。除大脑皮层外，小脑的RNAm6A甲基化模式和水平尤为突出。m6A甲基化与去甲基化的动态过程贯穿于小脑出生后发育的整个过程，且在低压低氧环境下Alkbh5基因缺失造成参与小脑发育调控进程基因的m6A水平紊乱，加快了RNA出核过程，从而导致小脑发育明显滞后。 通过Cre-loxP系统在小鼠的中枢神经系统中特异性地敲除Mettl3基因，以探究m6A甲基化修饰对中枢神经系统发育的影响。在中枢神经系统特异地敲除Mettl3导致小鼠在哺乳期表现出严重的运动功能障碍，并导致死亡。解剖和病理切片检测发现由Mettl3敲除引起的 m6A甲基化修饰的缺失严重影响大脑皮层和小脑的发育，导致大脑皮层偏薄和小脑发育不良。m6甲基化修饰的缺失引起小脑内颗粒神经元分化和成熟过程中基因表达调控紊乱，导致新生的颗粒神经元大量凋亡，揭示了 METTL3介导的m6A修饰在哺乳动物中枢神经系统发育中的重要作用。 除了对中枢神经系统发育的影响，m6A修饰也参与成体的神经系统调控，神经轴突损伤会促使神经细胞内m6A修饰水平提高，进而提高包括轴突再生相关基因在内的一系列基因的蛋白质翻译效率。
目前越来越多的研究表明，从细胞核内的前体mRNA 加工、mRNA表达到细胞质的 mRNA翻译和降解，m6A几乎参与调控了RNA加工代谢的各个过程。在细胞核内，m6A 通过结合蛋白YTHDC1招募SRSF3，参与调控前体mRNA的选择性剪接过程；通过调控最后一个外显子的选择性剪接，参与调控腺苷多聚体的多样性；而m6A修饰酶体系METTL3、ALKBH5和 YTHDC1还被发现参与调控mRNA的出核过程。在细胞质中，m6A调控翻译的机制十分多样，既有通过YTHDF1-eIF3通路调控mRNA翻译效率的方式，也存在 IGF2BP家族蛋白介导的调控过程，并且在应激状态下，m6A参与一类不依赖于5′ 帽子的翻译调控通路；并且其对mRNA稳定性的调控也存在不同的通路，既包括通过YTHDF2将 mRNA招募至P小体降解mRNA的调控方式，近期有报道指出IGF2BP家族蛋白通过特异性结合m6A修饰mRNA维持其稳定性。此外，m6A还可通过调控RNA的二级结构调控其代谢过程。
近年来越来越多的研究表明，mRNA上的m5C修饰在RNA加工代谢及正常生理过程中发挥重要的调控作用，包括RNA代谢、干细胞分化及应激反应等过程。对小鼠胚胎干细胞和大脑的研究表明，在干细胞分化不同时期，m5C修饰水平和分布明显不同。在拟南芥中，mRNA上的m5C修饰呈现组织特异性，且对植物发育非常重要。拟南芥中的m5C甲基转移酶TRM4B突变体植株的根顶端分生组织细胞分裂受阻，从而导致除根较短，并且对氧化应激非常敏感。 在读码器和消码器的共同作用下，RNA m6A修饰水平得以实现动态调控，并通过招募不同的结合蛋白实现对RNA加工过程的精细调控。虽然该研究领域还有部分观点存在不确定性，需要在将来投入更多的研究工作来证明。目前通过改造DNA聚合酶实现m6A修饰位点错配以检测单碱基精度的m6A转录组修饰水平，以及借助纳米孔测序直接检测转录本上鉴定 RNA修饰的技术，已成为领域内最热门的研究热点。该技术的实现，将成为阐明m6A修饰动态调控机制及其分子功能的核心关键。 对于m5C修饰，更为精确的m5C检测方法的开发对于高可信度的m5C修饰谱的建立至关重要。同样，纳米孔测序对于m5C的研究也非常重要。其次，m5C的书写器、阅读器和擦除器的研究才刚刚开始，这些方向的发展将为揭示RNA m5C修饰的生物学功能提供线索。此外，由m5C氧化产生的5-羟甲基−胞嘧啶(hm5C)等新型RNA修饰类型的特征及功能也有待未来进行深入研究。 除了m6A与m5C之外，RNA新型化学修饰也是近期研究的热点。最近研究人员发现 mRNA上还存在另外一种新型甲基化修饰——m1A，研究人员利用特异识别m1A的抗体来富集含有m1A的RNA片段并结合高通量测序，获得了全转录组水平的m1A甲基化谱图，发现m1A特异富集在5′非翻译区(5′UTR)区域；并且，还发展出单碱基分辨率的m1A 检测方法，发现核编码和线粒体编码转录本上存在不同类型的m1A甲基化组。目前对于 mRNA上m1A 修饰的研究仍然处于起步阶段，例如5′UTR的m1A甲基转移酶，m1A修饰参与RNA代谢调控的具体分子机制，m1A修饰是否像m6A修饰一样在多个生物学过程中发挥调控作用等都有待未来进行深入的研究。 综上所述，以m6A为代表的RNA修饰在RNA加工及生命过程中扮演着重要的调控作用(表1)。随着研究的深入及先进技术的开发，RNA 修饰调控基因表达的生物学过程与机制一定会更加清楚。 m6A甲基化的整体研究思路：m6A课题如何设计 | m6A专题 m6A甲基化整体研究思路：m6A相关SCI论文发表要求分类汇编 | m6A专题 你以为做完m6A测序后就完了？m6A-IP-qPCR了解下！ m6A去甲基化酶FTO对急性骨髓白血病有致癌作用 | m6A专题（6） Nature：YTHDF2介导mRNA降解导致子代斑马鱼发育迟缓 | m6A专题（7） Nature：m6A甲基化修饰在造血干细胞发育中的关键作用 | m6A专题（8） 案例解析：m6A-seq揭示拟南芥RNA甲基化独特特性 | m6A专题 案例解析：拟南芥去甲基化酶ALKBH10调控成花转变 | m6A专题 案例解析：RNA甲基化转移酶METTL14影响肝癌转移 | m6A专题 Nature：m6A调控miRNA初级体识别加工 | RNA甲基化套路解读 史上最详细RNA甲基化套路解读 | m6A调节果蝇性别分化和神经功能 案例解析：m6A-YTH组件调控拟南芥叶片发育时间和形态发生 | m6A专题 案例解析：拟南芥m6A甲基化酶FIP37调控茎尖分生组织发育 | m6A专题 案例解析：m6A-YTH组件调控拟南芥叶片发育时间和形态发生 | m6A专题 案例解析：METTL3上调肝癌中m6A水平引起YTHDF2介导SOCS2降解 | m6A专题 lincRNA1281上m6A修饰影响胚胎干细胞分化 | m6A专题 病毒m6A专题 | HIV感染宿主促进病毒及T细胞m6A修饰 手把手教你做m6A-IP-qPCR并计算相对表达量 | m6A专题 Mol Cell：mRNA的选择性翻译受RNA甲基化(m6A)调控 | 翻译组 文章整理自“RNA甲基化修饰调控和规律”一文 |
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