第三代基因剪刀诞生！可极大降低脱靶效应，让基因编辑更精确

近日，被誉为“基因编辑技术之父”的张锋在线发表新文章，宣布开发出了第三代基因编辑工具CRISPR/Cas12b。同样，在去年12月来自中国科学院动物所的周琪和李伟研究员也发表文献，实验结果与张锋基本一致，同样挖掘出了全新的基因编辑工具。那么这个可以说将改变整个生物医学领域的发现究竟是什么呢？我们可以通过第一代基因编辑工具CRISPR/Cas9对其进行全面了解。

什么是CRISPR/Cas？

我们都知道人类有强大的免疫系统来抵抗细菌，那细菌的免疫系统是什么呢？经过科学家的研究发现，细菌存在一种称作CRISPR的免疫系统可以抵御病毒，CRISPR来源于英文单词的缩写，代表特殊的DNA重复序列家族，目前已经发现其存在于许多细菌中。而和CRISPR共同完成免疫工作的搭档就是Cas蛋白，在细菌感受到有病毒入侵时CRISPR和Cas能一起合作，将病毒DNA或RNA切碎，保存自己的性命。这也就是其被称作CRISPR/Cas系统的原因。

图注：细菌体内的CRISPR位点，其中，CRISPR序列包含识别已入侵过细菌的外源DNA，相当于“黑名单”；Cas基因可编码Cas蛋白，对黑名单中的病毒DNA进行切割

既然细菌能切割DNA，那我们把它拿出来不是就可以切割动植物的基因了？科学家也是这么想的，他们看中了CRISPR系统的这种特性，将其改造后成为了新一代基因编辑工具。现在我们之所以对基因编辑这四个字耳熟能详，也要得益于CRISPR的出现，因为其实用性很强又易于改造，一时间就风靡了全世界的实验室。

2012年8月，美国加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna在《Science》杂志上发表文章，介绍了此系统如何工作，并表示可通过更换系统组件对其重新编程。从那时起，这一研究就一发不可收拾。2013年，张锋在Jennifer发表的原理基础上，发明了基于CRISPR的基因编辑工具，并在次年获得专利批准。

图注：三代基因编辑工具发明人张锋

张锋专利的核心内容就是CRISPR/Cas9，它的诞生改变了整个生物学研究进程。那专利中Cas9后面的这个数字是什么意思呢？原来这是根据蛋白的亚型和功能来定义的。Cas蛋白作为一个家族，里面有许多成员，各自有各自不同的作用，科学家根据种类不同也对其进行了编号，这也就是Cas蛋白后面的小数字。比如Cas1和Cas2是非常关键的蛋白，对识别入侵者的DNA序列很重要，而Cas4可以引导Cas1和2，完成系统“沟通”工作。当然最关键的一步就要靠Cas9来完成，它是一种核酸酶（功能性蛋白），可以切割DNA序列。

图注：应用广泛的CRISPR/Cas9系统（Cas9蛋白和向导RNA的结合体），其中，向导RNA相当于人为设计的“黑名单”，通过与DNA配对找到需要切开的位点；Cas9蛋白在该位点实行切开

功能强大的CRISPR系统

为什么说它改变了生物学进程？要知道，在此之前并不是没有基因编辑工具，而是有两种被称作ZFN和TALEN的技术。但是二者具有资金高、操作困难、动物体副作用等缺点。最关键的一点是，这两个都属于人造技术，而CRISPR是纯天然的。此外CRISPR只要构建一个简单的引导RNA就能工作，做一个同样的实验，时间大约能节约2-3天；所有原材料也不需要从公司购买，可以直接节省大量科研成本；最重要的是其改造DNA的能力非常出彩，完全达到基因编辑中“多快好省”的标准。

图注：CRISPR/Cas9 技术简单又高效，被称为基因的剪刀

科学家们都意识到这种技术必然是革命性和诺奖级的，不免也激起了之后持续数年的CRISPR的专利之争。上面提到的Jennifer Doudna与张锋曾就CRISPR/Cas9技术专利争夺了近数年。直到2017年2月，美国专利及商标局终于做出裁决——三名法官一致认为张锋申请的CRISPR/Cas9基因编辑专利，与Jennifer的发现，并不存在冲突。换句话说，两家申请的专利涵盖并不重复，因此张锋保留了在2014年获批的CRISPR/Cas9专利权。

这一事件也首次将CRISPR拉进了公众视野，即使有专利争夺战，但几乎没有什么可以阻挡CRISPR发展的强劲势头。仅仅在第一代工具释出后两年，张锋就于2015年发表了第二代基因编辑工具CRISPR/Cas12a，同样，后面的数字只是代表新发现的Cas蛋白亚型。

而现在，第三代编辑工具CRISPR/Cas12b也横空出世，这对于科学家来说是一个极大的好消息，从张锋所提供的文献中来看，第三代工具可以极大地降低脱靶效应！这是之前CRISPR系统的一大硬伤，如果能克服，科学界将再也找不到不使用它的理由。此外第三代工具因为其特性，更适合实验操作，可以显著提升实验成功率。这不仅对科学家来说有很多益处，一旦投入使用，其带来的好处将会影响每一个人的生活。

图注：张锋文献给出的三种蛋白比较；其中，CRISPR/Cas12b可显著降低脱靶率

会不会有新的专利之争？

无独有偶，来自中科院动物所的科学家也在做同样的事情。其去年12月发表的文献中提到，他们的实验团队也开发出了第三代工具CRISPR/Cas12b。那其和张锋的有何区别呢？为此，《环球科学》特别采访了论文的通讯作者，中科院动物所的李伟研究员。他告诉我们，两个研究的系统并不一样，首先他们的Cas蛋白来自于不同的细菌，并且两个实验的改造过程和蛋白性质也完全不相同。他提到这种工具一旦验证可行，是会提供给整个科学界共同使用的，并且已经提交了国际专利申请。

这会引起第三代编辑工具专利之争吗？《环球科学》同时采访了武汉科技局的相关人员，据悉，专利申请本身周期较长，通常一个专利申请呈递上去后正常情况下需要20个月才能审批下来，而动物所申请国际专利的时间跨度可能就更大。在专利发表之前网络搜索不到申请内容，因此张锋有没有申请专利，目前处于专利申请哪个阶段是不可知的。

此外，文献发表时间的早晚与专利申请之间没有必然联系，只要专利申请提交日期在文章发表前即是有效的。也就是说现在虽然中科院动物所的文献发表较早，但是只要张锋的专利先于其提交上去并被批准，仍然能抢先拿到专利。

况且，从Jennifer当年与张锋的专利之争看来，专利的界限定位可以非常小，也就是说只要创新度足够，是完全可以成为两个“并不存在冲突”的专利申请。从目前两篇文献来看，二者的发现过程，改造过程，应用方法是完全不一样的，因此成为互不冲突的专利机会很大。究竟三代技术花落谁家？还是皆大欢喜？我们一起拭目以待吧！

作者 | 杨心舟