华西医院袁泉组发现Mettl3介导的m6A RNA甲基化可以调控骨髓间充质干细胞和骨质疏松症 | 文...

N6-甲基腺苷 (N6-methyladenosine，m6A)是真核mRNA中最丰富的表观遗传修饰，是哺乳动物发育和疾病控制过程中多个RNA加工过程的基础。我们在此表明，条件敲除骨髓间充质干细胞(MSCs)中m6A甲基转移酶Mettl3可诱导小鼠骨质疏松症的病理特征。Mettl3功能缺失导致骨形成受损，成骨分化潜能低下，骨髓脂肪增多。此外，MSCs中Mettl3过表达可保护小鼠免受雌激素缺乏引起的骨质疏松症。在机制上，我们认为PTH(甲状旁腺激素)/Pth1r(甲状旁腺激素受体-1)信号轴是MSCs中受m6A调控的重要下游通路。敲除Mettl3降低了MSCs谱系分配器Pth1r的翻译效率，并干扰了PTH诱导的体内成骨和脂肪反应。我们的结果描述了在骨髓间充质干细胞中m6A失调的病理结果，并揭示了新的骨骼健康和疾病的表观转录组学机制。

BMSCs是成骨细胞和骨髓脂肪细胞的常见祖细胞。BMSCs成骨分化和脂肪分化的相互平衡受到严格的时空控制，以保障骨骼健康。年龄相关性骨质疏松症的特点是骨量低，骨髓环境中脂肪组织积累过多。在衰老或激素紊乱等其他病理刺激下，骨髓间充质干细胞优先向脂肪细胞分化，导致骨髓脂肪增多，骨量逐渐流失。这些骨骼微结构的改变导致骨骼脆性和骨折敏感性的增加。然而，骨髓间充质干细胞谱系分配更倾向于成脂分化而非成骨分化的明确机制尚不清楚。

m6A是是最普遍的转录后内部mRNA修饰，调节各种生理过程。在哺乳动物中，m6A可以被甲基转移酶复合物（由一个酶亚基METTL3、一个底物识别亚基METTL14和一个调节亚基WTAP组成）催化，也可以被去甲基化酶FTO和ALKBH5清除。在分子水平上，m6A被动态地移除或安装在受其调控的转录物中，来调控RNA代谢（包括选择性剪接、RNA稳定性和翻译），以此来对正常细胞过程中或应激或疾病状态下的多种信号作出响应。m6A甲基化的转录物表达改变随后会影响其所在细胞的功能、身份和分化干性，并通过环境依赖的方式决定细胞的命运。最近的体内研究在解释m6A在哺乳动物发育中的有趣作用方面取得了重大突破。Mettl3和/或Mettl14缺失时，异常的m6A水平会减弱细胞周期进展，扰乱功能干细胞的正常谱系定型和分化，导致神经发育迟缓、免疫缺陷和不育。鉴于m6A与健康和疾病的密切相关性，我们重点探讨m6A在骨内稳态中的潜在作用，而这方面的研究很少。

通过构建条件敲除和敲入突变小鼠，我们揭示了m6A在调控MSCs分化中的重要作用，并发现PTH/Pth1r信号轴是m6A重要的下游机制通路。我们的发现为m6A在骨骼健康和疾病中的关键调节作用提供了新的思路。

背景概括：

1. 在衰老或激素紊乱等其他病理刺激下，骨髓间充质干细胞优先向脂肪细胞分化而非成骨分化的明确机制尚不清楚。

2. m6A是最普遍的转录后内部mRNA修饰，调节各种生理过程，已有研究表明m6A能影响干细胞分化。

3. m6A在骨内稳态中的作用尚不知晓。

结果：

1. 条件性敲除MSCs中的Mettl3导致低骨量和高骨髓脂肪
2. MSCs中Mettl3缺失导致成骨潜能降低和脂肪分化增加
3. Lepr+ MSCs中Mettl3缺失导致成骨受损和骨髓脂肪堆积
4. 过表达Mettl3可防止雌激素不足引起的骨质疏松症
5. m6A调控Pth1r的翻译
6. m6A是发挥PTH功能的基础
7. 过表达Pth1r部分挽救了mettl3缺失的MSCs的正常谱系分化

1. 条件性敲除MSCs中的Mettl3导致低骨量和高骨髓脂肪
【检测生理表达】为了研究Mettl3在骨髓间充质干细胞谱系分化和骨病中的潜在作用，我们首先检测了小鼠骨组织中Mettl3的表达。免疫染色显示Mettl3（棕色）在小鼠骨细胞和骨髓中均有显著表达，但在生长板区软骨细胞中无明显表达。（SFig.1）
【为后文埋下伏笔：mettl3不直接影响软骨细胞】

由于基因组Mettl3敲除是胚胎致死的，我们利用CRISPR/Cas9技术产生了Mettl3 flox (Mettl3 fl/+)小鼠，然后将Prx1-Cre转基因小鼠与Mettl3 fl/+小鼠杂交，获得纯合的Mettl3条件敲除小鼠（Prx1-Cre;Mettl3 fl/fl小鼠），以及杂合的Mettl3敲除小鼠（Prx1-Cre;Mettl3 fl/+小鼠）。Prx1-Cre;Mettl3 fl/fl小鼠可以存活，但存活率较低，同时显示雌雄比例约1：4.5，与之前的研究一致。与同周龄的同窝出生小鼠相比，Prx1-Cre;Mettl3 fl/fl小鼠具有体积小、重量轻、生长发育迟缓等特点。（SFig.2a-d）

股骨石蜡切片免疫染色和western blot分析证实Mettl3的敲除是成功的，从而降低了MSCs中m6A的水平。（SFig.2e-g）

【成骨↓】股骨远端干骺端的骨小梁μCT分析显示骨矿物质密度(BMD)及骨体积/组织体积比(BV/TV)在Prx1-Cre;Mettl3 fl/fl和Prx1-Cre;Mettl3 fl/+雄性小鼠中显著降低。此外，Mettl3缺失还可减少骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)和中轴皮质骨厚度(Ct.Th)，同时增加骨小梁间隙(Tb.Sp)。(Fig. 1a, b)

【成骨↓破骨↑】未脱钙切片的Von Kossa染色进一步证实了Prx1-Cre;Mettl3fl/fl小鼠的低骨量表型(Fig. 1c)。此外，Mettl3条件敲除小鼠的矿物沉积率(MAR)和骨形成率(BFR)较慢，成骨细胞数量(N.Ob/B.Pm)较低(Fig. 1e)，说明MSCs中Mettl3的缺失导致小鼠骨形成受损。我们还在Prx1-Cre;Mettl3 fl/fl小鼠中观察到更活跃的破骨细胞状态(Fig.1d, e)，支持Mettl3条件敲除小鼠发生更快的骨组织破坏。
【注意】破骨细胞集中在大脂肪细胞附近，与最近观点（PTH1R缺失前提下脂肪细胞是RANKL的来源）相一致。Fan, Y. et al. Parathyroid hormone directs bone marrow mesenchymal cell fate. Cell. Metab. 25, 661–672 (2017).

【不影响软骨】敲除Mettl3只导致生长板及肥厚区域（软骨细胞）略微缩短，但没有显著缩短。（SFig.3）

有趣的是，我们观察到在Prx1-Cre;Mettl3fl/fl小鼠中，骨量的丢失与骨髓脂肪组织(MAT)的明显增加有关（Fig.1f）。与对照组相比，Prx1-Cre；Mettl3fl/fl小鼠骨髓脂肪细胞数量和密度均升高（Fig.1g）。

总的来说，Mettl3条件敲除小鼠的骨骼表现与骨质疏松症的病理表型相似，提示m6A甲基化水平较低的MSCs存在谱系分化障碍。

2. MSCs中Mettl3缺失导致成骨潜能降低和脂肪分化增加
【体外验证成骨成脂】接下来，我们从Mettl3fl/fl和Prx1-Cre;Mettl3fl/fl小鼠中分离出MSCs，验证其体外成骨和成脂潜能。Mettl3缺失的MSCsALP染色较弱，钙矿化程度较低，提示成骨分化能力下降；同时成骨标志物Runx2、Sp7、Alp、Bglap的表达下调。相反,Prx1-Cre;Mettl3fl/flMSCs的油红O染色增强和成脂分化表达水平显著提高,包括Pparγ，Cebpα,Adipoq, Plin1,和CD36,提示成脂分化潜能增强。（Fig.2）

3. Lepr+ MSCs中Mettl3缺失导致成骨受损和骨髓脂肪堆积
【后期敲除】接下来我们探究Mettl3在骨形成的后期是否具有同等的重要性。为此，我们使用Lepr-Cre （主要靶向于成熟骨髓中形成骨组织的MSCs）再次构建条件敲除小鼠。Lepr-Cre;Mettl3fl/fl小鼠再现了Prx1-Cre小鼠的抑制成骨和脂肪促进作用。Lepr+MSCs中Mettl3缺失导致BMD, BV/TV, Tb.N和 Tb.Th下调。组织学检测显示Lepr-Cre；Mettl3fl/fl小鼠骨髓中脂肪组织含量较Mettl3fl/fl小鼠高。对脂肪细胞的定量分析显示，敲除小鼠的脂肪细胞数量和密度都比对照组增加了一倍以上。（Fig.3）

4. 过表达Mettl3可防止雌激素不足引起的骨质疏松症
【过表达】考虑到Mettl3缺失在诱发骨质疏松症中的病理效应，我们推测Mettl3过表达是否能够增强骨骼健康或预防骨骼疾病。为此，我们制备了Prx1-Cre驱动的Mettl3-tdTomato（tdTomato红色荧光蛋白）敲入小鼠(Prx1-Cre;Mettl3KI/KI)，使其在MSCs中条件性地过表达Mettl3。Prx1-Cre;Mettl3KI/KI小鼠均可存活，并符合孟德尔定律。（SFig.4）

【骨松造模】为了研究Mettl3过表达对骨质疏松症的潜在保护作用，我们对9周龄Prx1-Cre；Mettl3KI/KI雌性小鼠及其对照组小鼠进行卵巢切除术(OVX)，这是绝经后骨质疏松症的经典模型，绝经后雌激素的缺乏导致骨重塑不平衡，骨髓脂肪沉积增加。

虽然在假手术组中Prx1-Cre;Mettl3KI/KI小鼠的骨量变化不明显，但OVX后Mettl3敲除小鼠的骨小梁骨密度和骨量丢失较少。Mettl3过表达时骨小梁数量和厚度减少及骨小梁间隙增加不明显。（Fig.4ab）

此外，Mettl3过表达增加了OVX后小鼠成骨细胞数量，但不影响破骨细胞活性。（Fig.4c-e）
【注意】前述造模前破骨细胞数量显著上升，此处OC变化不大，提示雌激素对OC的作用大于mettl3的作用

HE染色和组织形态学分析显示，OVX组对照小鼠骨髓脂肪细胞过度积累，而Prx1-Cre;Mettl3KI/KI小鼠骨髓脂肪细胞的增加较少。（Fig.4fg）

5. m6A调控Pth1r的翻译
【测序及基因分析】为了深入探讨Mettl3调控MSCs命运和骨形成的内在机制，我们采用m6A MeRIP-Seq技术鉴定m6A在MSCs中的关键靶点。

如补充图5a-c所示,GGAC序列基序富集于MSCs中识别的m6A位点(补充图5a),多数m6A位点位于CDS（coding sequence，蛋白质编码区）和3'UTR区域,一小部分峰值位于5'UTR和内含子区域(补充图5b)。Metagene分析显示，m6A位点主要位于翻译终止密码子附近(补充图5c)。

【阅读文献发现Pth1r具有相关性】此外，我们通过阅读文献发现Pth1r，一种MSCs谱系分化和成骨细胞前体中的关键调节因子，在其翻译终止密码子附近具有高度富集和特异性的m6A峰。（Fig.5ab）

接下来，我们进行RNA测序(RNA-seq)，检测从Prx1-Cre；Mettl3fl/fl小鼠和Mettl3fl/fl对照中分离的MSCs的转录组谱，证实成骨标记基因如Dlx5、Sp7、Alpl、Bglap表达下调，而脂肪细胞分化标记基因如Pparg、Plin1、Fabp4表达上调。（Fig.5c）

【深入探究PTH/Pth1r信号轴】PTH1R（一个关键的PTH受体和PTH相关蛋白类似物）和abaloparatide两者都是FDA批准的治疗骨质疏松症的合成药物,是PTH调节骨内稳态必不可少的。为了证实m6A调节Pth1r，我们运用已发表的PTH调节基因列表对我们的RNA-seq数据结果进行基因富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)。我们发现Mettl3缺失MSCs的PTH调控基因表达整体下调，提示PTH/Pth1r信号轴可能是Mettl3介导m6A甲基化调控MSCs命运的潜在机制。（Fig.5d）

【翻译水平】RNA-seq和定量RT-PCR都显示Mettl3敲除并不影响Pth1r的mRNA表达,而Mettl3敲除抑制Pth1r蛋白质合成，降低翻译效率,这表明m6A甲基化在翻译水平影响Pth1r表达。（Fig.5e-g）

我们随后用蔗糖密度梯度离心法分离Mettl3敲除和对照MSCs的多聚核糖体，并用RTPCR检测在不同核糖体片段中内源性Pth1r mRNA的分布。我们的数据显示，在Mettl3敲除细胞中，Pth1r mRNA的相对分布由多聚核糖体部分向亚基部分转移（40/60/80S构成核糖体的亚基），说明Mettl3的缺失导致Pth1r mRNA的翻译效率降低。（Fig.5hi）

【蔗糖密度梯度离心法】：又称速率—区带离心,沉降系数较接近的物质分离的方法；
原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。常用的有蔗糖、甘油；
密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度。

【多聚核糖体】：指合成蛋白质时，多个甚至几十个核糖体串联附着在一条mRNA分子上，形成的似念珠状结构。

6. m6A是发挥PTH功能的基础
【检测PTH/Pth1r轴生理功能是否受影响】由于Mettl3缺失阻碍了Pth1r蛋白的合成，我们接下来检测了Mettl3缺失时PTH/Pth1r轴的生理功能。cAMP依赖性蛋白激酶A (PKA)和细胞外信号调节激酶(ERK)通路是PTH合成过程中介导细胞内信号和生理反应的重要下游通路。
Mettl3的缺失减弱了PTH诱导的cAMP积累，因而抑制cAMP反应元件结合蛋白(CREB)的下游磷酸化。同时，尽管Mettl3缺失MSCs与对照MSCs具有相同的ERK1/2基础水平，但其在PTH处理后未能激活ERK1/2通路。（Fig.6ab）

【PTH治疗挽救】为了研究Mettl3在PTH介导体内骨重塑中的潜在作用，我们对3个月大的Mettl3fl/fl和Prx1-Cre;Mettl3fl/+雌性小鼠进行间歇性PTH(1-34)注射，来比较它们对PTH治疗的反应。与对照组中小梁骨量的急剧增长相比，Prx1-Cre;Mettl3fl/+小鼠BMD, BV/TV, Tb.N和 Tb.Sp仅发生轻微变化。（Fig.6cd）
【PTH（1-34）】完整的人PTH为一单链蛋白质，含84个氨基酸残基。N端为PTH的活性端，1-34氨基酸即具备完整PTH的活性。人体血液中存在多种PTH片段。

此外，Prx1-Cre;Mettl3fl/+小鼠在PTH治疗后骨重塑未见有效增加，证实敲除Mettl3可减弱PTH诱导的成骨作用。（Fig.6e-g）

除了在成骨过程中显著富集外，PTH还通过抑制脂肪细胞分化来促进骨形成。在我们的实验中，PTH注射显著降低了Mettl3fl/fl小鼠的MAT积累，但难以逆转Prx1-Cre;Mettl3fl/+小鼠的高骨髓脂肪含量，巩固了我们的发现：m6A通过调节PTH/Pth1r信号轴影响MSCs成骨和成脂分化。（Fig.6hi）

7. 过表达Pth1r部分挽救了mettl3缺失的MSCs的正常谱系分化
【过表达】接下来，我们将过表达Pth1r的腺病毒 (Ad-Pth1r)转导到MSCs中。Ad-Pth1r成功恢复Prx1-Cre;Mettl3fl/fl MSCs中Pth1r的蛋白水平(Fig.7a)，并且显著提高ALP活性和钙结节形成(Fig.7b,c)。

此外，Pth1r过表达改善了m6A降低后油红O染色强度的增加。(Fig.7e)

qRT-PCR分析显示Pth1r转导后成骨标志物上调，成脂标志物下调。(Fig.7df)

讨论：
Mettl3介导的真核RNA m6A修饰对巩固稳态有广泛的功能影响，而m6A水平的任何扰动都可能导致功能障碍或疾病。最近的研究陆续揭示了m6A修饰与干细胞调控之间错综复杂的关系。m6A水平失调扰乱了实时控制的胚胎干细胞分化，破坏了造血干细胞的正常生成和分化，抑制了神经发生、精子发生和T细胞稳态的功能发育。利用不同时段的间充质干细胞标记物Prx1和Lepr，我们分别建立了早期肢体间充质敲除Mettl3和成体骨髓敲除Mettl3的两种小鼠模型。我们发现骨髓间充质干细胞中Mettl3的缺失扰乱了细胞分化，导致骨质疏松症病理表型，如成骨分化潜能低下的骨量减少，成脂分化潜能增强的骨髓脂肪增多，揭示了m6A对骨髓间充质干细胞的特异性调控。此外，Mettl3功能的恢复可预防雌激素不足引起的绝经后骨质疏松症，确立了Mettl3在BMSC分化过程中不可或缺的作用。

越来越多的证据表明m6A在翻译中的调节作用。m6A与m6A 阅读器合作，促进翻译起始，并对热休克应激下的选择性mRNA翻译做出反应。m6A标记转录物翻译效率的改变影响正常的造血和哺乳动物精子发生。在这里我们发现m6A对于Pth1r的翻译是必不可少的。Mettl3缺失导致Pth1r mRNA从多核糖体向亚基转移，从而减慢了Pth1r的蛋白合成，进一步阻断了Pth1r对PTH应答的下游信号通路。

间歇性PTH治疗通过增加成骨细胞数量、延缓成骨细胞凋亡、活化骨内衬细胞、减少骨髓脂肪来促进骨形成。PTH1R是促骨髓间充质干细胞成骨分化中PTH的直接信号传导介质，而异常的PTH1R表达可作为特征性脂肪分化的结果导致MAT积累。敲除Mettl3可降低小鼠m6A的整体甲基化水平，显著降低Pth1r功能。间歇性注射PTH(1-34)后，m6A缺陷小鼠骨髓脂肪含量持续偏高，骨量升高不明显，支持了m6A缺陷对PTH合成效应的影响。我们随后发现，Pth1r过表达可在很大程度上逆转MSCs向脂肪细胞的分化倾向，改善成骨，进一步证实了PTH/Pth1r信号通路是mettl3介导的m6A修饰调控MSCs谱系分化的一种新机制。

PTH还能通过它的受体来提高RANKL/OPG比率，从而刺激破骨细胞的形成和活动。虽然在我们的研究中，Mettl3敲除对Pth1r的蛋白合成有很大的影响，但我们发现破骨细胞的数量明显增加。我们推测，破骨细胞增加的一个原因是，除了Pth1r外，Mettl3在骨细胞中还有另一个相关的靶点，因为Pth1r的过表达只起到了部分挽救作用。另一种可能的解释是Pth1r功能障碍时，MSCs的脂肪分化倾向促进破骨细胞活性。Fan等在最近的研究中证明，在缺乏PTH1R信号的情况下，骨髓脂肪细胞是RANKL的来源。与他们的结果相似，我们的TRAP染色显示Mettl3突变小鼠破骨细胞位于大脂肪细胞附近。因此，我们推测Mettl3条件敲除小鼠骨髓脂肪组织过度积累也可能是破骨细胞数量增加的原因。

值得注意的是，不同于Fan等报道的Prx1-Cre；PTH1Rfl/fl小鼠中严重的软骨发育不良，我们只观察到Prx1-Cre;Mettl3fl/fl小鼠中生长板细胞结构发生了轻微但不显著的变化。我们发现Mettl3在生长板软骨细胞中不表达，因此可能不参与软骨发生，可以解释生长板表型的这种差异。Prx1-Cre；Mettl3fl/fl小鼠与对照组之间的肥厚区存在微小差异，这可能是由于Pth1r对mettl3缺失成骨细胞的间接影响，进而影响生长板软骨内血管化。

综上所述，我们证明早期骨髓间充质干细胞中m6A表观遗传修饰的减少抑制哺乳动物Pth1r的翻译，并在骨生长过程中阻断其对PTH的合成反应。这些功能缺陷使MSCs的分化平衡向脂肪谱系倾斜，导致严重的骨质流失和过度的MAT堆积。我们的数据丰富了m6A调控干细胞分化的证据，揭示了失调的m6A修饰与骨病理紊乱之间的功能联系，从而为骨质疏松症新治疗策略的开发提供了新的思路。

参考文献：

Wu, Y., et al. Mettl3-mediated m(6)A RNA methylation regulates the fate of bone marrow mesenchymal stem cells and osteoporosis. Nat Commun 9, 4772 (2018).

各位读者：