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近来打算抽出相当时间，把基因测序从头到尾好好理一理，包括一代、二代、三代。不求全面无遗漏，这个太难了，但是力求把主要的、有代表性的技术都囊括其中。 由于难以花费大量时间去反复查证资料，文章的写作主要靠记忆，不当之处在所难免。希望大家在文章中看到错误的地方，不要客气，随时指正。作者飞船感谢大家的帮助。 DNA测序是在核酸的酶学和生物化学基础上创立、发展起来的一门实用技术，它在分子生物学基础研究和应用研究中都有应用的广泛，涉及到研究基因的结构与功能、进化、遗传病、肿瘤、亲子鉴定、犯罪嫌疑人鉴定等许多领域，其中不乏像精准医疗、染色体病的无创产前鉴定、利用游离肿瘤DNA或游离肿瘤细胞进行肿瘤的早期诊断和疗效监控、肿瘤靶向药研发、免疫细胞治疗、基因编辑等潜力巨大、激动人心的前沿热点。人们运用DNA测序技术不断取得重大科学发现，为促进学科进步和改善人类健康作出了巨大贡献。分子生物学实验技术种类繁多，精彩纷呈，DNA测序是其中少数生命力强大、能够持续焕发光彩的经典之作之一。
1 DNA测序技术进展概述 DNA测序技术首先于1977年发明，到现在已经快40年了。四十年来，测序技术本身也在不断改善、发展和进化，特别是2007年前后出现的二代测序技术是一个重大突破，代表了测序技术里程碑式的飞跃。二代测序技术一方面使得每次测序所能得到的碱基数据量从100 k (105)量级大踏步跨越到G (109)和T (1012)量级，一方面带来测序成本的快速下降，降幅之大，超过计算机领域著名的摩尔定律4倍(图1)，个人基因组的测序成本因此跨越1000美元门槛，堪称革命性突破。结合大数据、云计算等新兴技术手段，二代测序成为科学家们开拓更广泛研究领域的强有力武器，并直接促成了美国总统奥巴马提出精准医疗计划。 图1 个人基因组测序成本变化趋势
迄今为止，现有的DNA测序技术可以根据其技术特征划分为3代。下面选择其中比较主要和有代表性的，分别作一简要介绍。除了这些测序方法之外，更多的正在研发过程中。 一代测序：也称Sanger测序、毛细管测序。技术上以双脱氧链终止技术为代表；仪器上以Applied Biosystems公司的3730型毛细管测序仪为代表；每次测序反应能够获得大约100k碱基。一代测序技术既可以用于测定DNA序列，也可以用于测定DNA分子的片段长度。其中基于片段分析的微卫星(STR)分析是现代法庭DNA鉴定的核心技术。 二代测序：也称高通量测序、大规模平行测序。技术上以Illumina公司的边合成边测序(sequencing bysynthesis, SBS)、Life Technologies公司(原Applied Biosystems公司，现ThermoFisher公司)的边连接边测序(sequencing byligation)和半导体测序(semiconductor sequencing)、Roche公司的焦磷酸测序(pyrosequencing)等为代表；仪器上以Illumina公司的HiSeq X10、LifeTechnologies公司的Ion Torrent、Ion Proton和SOLiD、Roche公司的GS FLXTitanium System等为代表；其中HiSeq X10每台机器每次测序反应能够获得大约1.8 T碱基。二代测序是实行精准医学计划的基石。 三代测序：也称单分子测序。技术上以Pacific Biosciences公司的单分子实时(singlemolecule real-time, SMRT)测序、Oxford NanoPore Technologies公司的纳米孔测序为代表；产品上以Pacific Biosciences公司的Sequel、NanoPore公司的MinIon等为代表。三代测序在测序数据量上并没有什么提高，甚至比二代测序的产量还低，但是SMRT技术的测序读长非常长，平均可达10-15 kb。这是三代测序的优势。在很多应用领域，三代测序可以作为二代测序的有益补充。
2 一代测序 1970年代，英国和美国的科学家们先后发明了两种DNA测序技术：Sanger发明的酶法；Maxam和Gilbert发明的化学修饰法。后来经过不断改进，Sanger法逐步由手工操作发展到使用毛细管测序仪自动化操作，在生物学基础研究、医学和法庭DNA鉴定等领域获得广泛应用。其中法庭DNA鉴定是一项极其杰出的应用，为亲子鉴定、罪犯嫌疑人鉴定、细菌和真菌物种鉴定等作出了巨大贡献。直到现在，它仍然是十分先进和高效可靠的法庭鉴定技术之一，为刑事案件的侦破提供强大的证据。 酶法和化学修饰法这两种DNA测序方法都属于一代测序。 DNA测序技术的发明者们因为这一杰出贡献而荣获诺贝尔奖。其中Sanger先生后来又发明了蛋白测序技术，第二次荣获诺贝尔奖。这样的成绩，在世界一流科学家当中也是凤毛麟角的。 （未完待续） |
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