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Circulating tumour DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma ● 期刊名： Nature Materials ● 发表时间： 2017年10月 ● 影响因子： 36.5 ● 文章类型： 目标区域捕获的DNA甲基化测序 HCC是全球致死率最高的癌症种类。对于HCC的早期诊断可以大大降低患者死亡率。至今为止，能够利用血液样本来诊断和监控HCC的生物标记物只有甲胎蛋白（Alpha fetal protein，AFP）。但是AFP对于HCC诊断的敏感性及特异性都不高。cfDNA是肿瘤细胞在坏死/凋亡过程中释放的DNA片段，其携带了癌症特异的遗传学以及表观遗传学特征。除了DNA序列变异，DNA甲基化状态差异也可以作为癌症早期诊断的生物标记。比如用于结直肠癌临床诊断的SEPT9，其是第一个被FDA批准的ctDNA甲基化标志物。相对于DNA序列变异，ctDNA的甲基化标志物拥有更丰富的多态性，对肿瘤的临床诊断敏感性更高。研究者认为，ctDNA甲基化状态很有潜力成为用于HCC的早期诊断的生物标记。 研究策略一 研究者从TCGA数据库中获取377例HCC组织样品的Illumina Infinium Human Methylation 450K EPIC芯片数据，并将这些数据与753名健康人的白细胞DNA的甲基化芯片数据（来自于研究者之前关于衰老的研究）进行对比。然后他们利用“moderated t-statistics”模型选出与HCC相关性最高1000个的甲基化位点。 图1 研究策略及流程 研究策略二 研究者们针对这1000个位点设计padlock探针。其中有682位点通过质检。将这些padlock探针混合后进行后续目标区域捕获DNA甲基化测序。Padlock的设计以及建库流程见图2。从1.5 mL血浆中，可以得到约15 ng ctDNA进行亚硫酸盐转化后。转化得到的DNA通过图2所示流程建库，并使用Illumina HiSeq测序平台测序。每个样品测序量需超过20,000 reads，使90%的位点的覆盖率超过20×。通过这种方式可以大大减低测序成本。 图2 bisulfite padlock probes 捕获及建库流程 研究策略三 研究者们比较了28对HCC组织和血液ctDNA样品对的目标区域捕获DNA甲基化测序数据，选择在两类样品中表现一致的401位点进行下面的测试。 研究策略四 以1275个样品（715 HCC/560 normal）的目标区域捕获DNA甲基化测序数据作为训练集，研究者们通过LASSO和Random forest方法建立HCC诊断预测模型，取交集后得到10个可靠的甲基化生物标志物（如表1）。最后研究者们在含有658个样品（383 HCC/275 normal）的验证集中对该模型进行了验证。
研究策略五 同时研究者也利用686个样品的训练集，通过LASSO建立了HCC预后预测模型，得到8个可靠的甲基化生物标志物，并用含有369个样品的验证集对该模型进行了验证。 表2 8个用于HCC预后预测的甲基化标志物特征统计表  研究结果一 研究者们用“moderated t-statistics”模型选出与HCC相关性最高的1000个的甲基化位，利用这些位点的甲基化状态信息对377例HCC组织样品以及753名健康人的白细胞样品进行了聚类分析。如图3，通过聚类分析，两类样品可以很好的被区分。这个结果说明这1000个选定的甲基化位点与HCC有比较好的相关性，可在这1000个位点中挑选甲基化生物标记物。 图3 利用HCC相关性最高1000个的甲基化位点对450K EPIC芯片数据进行无偏聚类分析 研究结果二 研究者们所建立的HCC诊断预测模型，在训练集及验证集数据中，敏感度都超过83%，特异性也都超过90%，ROC（receiver operator characteristic curve）的AUC超过0.94（图4）。这些结果说明这个含有10个甲基化标记物的HCC诊断预测模型可以很好的区分HCC患者和健康参与者。 图4 cfDNA的甲基化标志物可用HCC诊断 研究结果三 研究者们建立了含有10个甲基化标志物信息的HCC诊断预测模型来评估cd值（combined diagnostic score，unbiased coefficient estimates × the diagnostic marker methylation value）。ctDNA的 cd值与HCC的发病、治疗效果、预后以及病程发展都有较强的相关性（图5a，5b，5c，5d和5e）。相比于AFP，ctDNA cd值可以更好的反应治疗效果（图5f）。 图5 ctDNA甲基化ct值与HCC肿瘤负荷、治疗响应以及病程相关 研究结果四 研究者们建立了含有8个甲基化标志物信息的HCC预后预测模型来评估cp值（combined prognostic score，unbiased coefficient estimates × the prognostic marker methylation value）。cp值大于0.24被认为是高风险组，cp值低于或等于0.24被认定为低风险组。训练集中的341个受试者有53个是高风险组，7个是低风险组。存活曲线显示各个时期高风险组生存率均明显低于低风险组（图6a）。在验证集中结果相似（图6b）。在检测集以及验证集数据中，cp值对于预后的评估能力都优于HCC分级，并且结合HCC分级后cp值对于HCC预后评估能力得到近一步增强（图6c和6d）。结合HCC分级与cp值对于整个HCC队列进行预后评估分组，结果显示各组的生存曲线有显著差异。这些结果说明ctDNA的甲基化分析可以用来进行HCC患者的危险分级以及预后评估。 图6 ctDNA甲基化标志物用于HCC患者的危险分级以及预后评估 参考文献：Xu R H , Wei W , Krawczyk M , et al. Circulating tumour DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma[J]. Nature Materials, 2017, 16(11):1155. 明码生物科技编译整理   |
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