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ELISA即酶联免疫吸附实验，是目前广泛应用于各种抗原抗体检测的方法，主要有灵敏度高和特异性强的特点。ELISA操作步骤看似简单，整个测定过程中却有诸多影响因素，导致检测结果可能与实际结果偏差较大。为帮助大家分析实验中常见问题，我们将常见问题的可能原因和解决方法归纳总结于下表： 问题一：高背景或阴性对照值偏高 可能原因 | 建议 | 阴性对照孔被阳性对照或样品污染 | 洗涤时，勿将洗液溢出孔外 | 抗体非特异性结合 | 封闭液不适合，更换封闭液 | 酶结合物过浓 | 请检查酶结合物是否按说明书规定稀释 | 孵育温度过高 | 检查孵育箱的温度是否正确、稳定 | 底物在使用前曝光 | 应保存在暗处，避光 | 读板前停留时间过长 | 加终止液后3分钟内读数 |
问题二：阳性对照值偏低或低吸光度
可能原因 | 建议 | 试剂未平衡至室温 | 实验开始前，将试剂盒从冰箱取出平衡至室温 | 检测体积偏小 | 检查移液器吸液管道是否堵塞 | 孵育时间过短 | 使用计时器，准确孵育时间 | 底物受污染 | 使用新配置的试剂，重新实验 | 包装袋中有湿气 | 检查袋中是否有干燥剂 | 样本中有抑制剂 | 叠氮钠会抑制HRP酶的活性 |
问题三：边缘效应
可能原因 | 建议 | 蒸发 | 各步之间，须使用封版胶密封反应板 | 温度不均匀 | 校准孵育箱，勿叠放反应板 |
问题四：标准曲线不佳
可能原因 | 建议 | 倍比稀释标准品时未混匀 | 稀释标准品的每一步均需混匀 | 过早稀释 | 标准品在快要使用时稀释 | 加入的体积不正确 | 使用校准过的移液器，快速、等量的将标准品分配到各个微孔中 |
问题五：标准曲标准曲线良好，但样本无检测信号
可能原因 | 建议 | 样本中无检测物或检测物含量极低 | 设置内参，重新实验 | 样本中其他物质影响/掩盖检测 | 作适当稀释，降低其他物质的干扰，或作系列稀释，检测回收率 | 样本中检测物浓度过高，Hook效应导致假低值 | 适当倍数稀释样本，检测物浓度尽量在试剂盒检测范围内 |
问题六：重复性较差
可能原因 | 建议 | 微孔中有气泡 | 用针尖挑破气泡 | 试剂未混匀 | 确保充分混匀试剂 | 样本中有杂质或沉淀物 | 使用前离心 | 微孔包被面被吸头划破 | 加液时小心操作 | 使用用过的封板胶纸 | 每次须使用新的封板胶封住反应孔 |
问题七：假阳性反应 可能原因 | 建议 | 洗涤不充分 | 使用前需检查洗板机是否正常工作 | 洗板机管道堵塞 | 需经常维护洗板机 | 加结合物时，洒在微孔边缘 | 小心向微孔加入结合物，加入微孔底部中央，避免与孔壁和边缘接触 | 检测样本中含有红细胞 | 离心 | 微孔中液体挥发 | 用封板胶密封反应孔，置于湿盒内 |
问题八：整块板产生阳性OD值或整个板显蓝色
可能原因 | 建议 | 洗涤液体积不足或底物被残留于孔底的结合物所污染 | 洗涤时，缓冲液充满至孔边缘，但要确保不能溢出孔外 | 结合物浓度过高 | 检查是否按照说明书推荐比例稀释 | 血清中有血清因子 | 勿加热血清 | 底物容器不洁净 | 用酸清洗容器瓶，用蒸馏水冲洗 | 底物孵育时，微孔板曝光 | 加底物时，立即将板置于暗处 |
问题九：整块板OD值偏低
可能原因 | 建议 | 显色时间不足 | 适当延长显色时间 | 孵育温度偏低 | 36度为最适反应温度（欣博盛ELISA试剂盒） | 未加终止液 | 加入终止液，增强颜色反应的强度，稳定最终的颜色反应 |
问题十：显色缓慢
可能原因 | 建议 | 样本未置于室温 | 实验开始前，将样本平衡至室温 | 酶结合物活性减弱 | 检测稀释度 | 酶活性收到抑制如叠氮钠 | 避免实验不当的防腐剂 | 显色温度不适当 | 按说明书操作 |
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