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恶性肿瘤作为全球较大的公共卫生问题之一，其发病率呈逐年上升的趋势，对人类健康和生命造成极大的威胁[1]。目前尽管在预防和治疗方面取得了较好的进展，但其仍是世界范围内导致死亡的主要原因，因而对肿瘤疾病的治疗一直是医药学界研究的重点[2]。大量临床研究表明，化学药物虽提高了多种恶性肿瘤的治愈率，但存在较强的毒副作用及耐药性等缺陷。中药治疗肿瘤具有较长的历史。目前其治疗恶性肿瘤包括清热解毒、扶正怯邪、活血化瘀、软坚散结、以毒攻毒等方法，具有多方位、多靶点及不易产生耐药性等优势，已经成为抗肿瘤新药研发的新方向[3-4]。 半枝莲为唇形科黄芩属植物半枝莲Scutellaria barbataD. Don的干燥全草，始载于《药镜拾遗赋》。其性辛、苦、寒，具有清热解毒、消肿止痛等功效[5]，中医常用其单方或复方治疗各种肿瘤。据《中华肿瘤治疗大成》载，半枝莲主治原发性肝癌、胃癌等消化道肿瘤，肺癌及子宫颈癌等[6]。现代药理学研究表明半枝莲具有很好的抗肿瘤活性，其主要通过抑制肿瘤增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成等途径发挥作用[7-9]。目前，对于其抗肿瘤机制已经形成了初步的认识，然而半枝莲发挥抗肿瘤活性的活性成分和作用机制尚未完全明确。 。网络药理学的出现为中药复杂体系的系统化研究提供了新思路[11]。郑春松等[12]从网络药理学角度揭示了白芍活性分子群可作用于MAPK、JNK、P13K-AKT信号通路，发挥抑制炎症和骨破坏作用，从而达到治疗类风湿关节炎的药效。张潇等[13]基于网络药理学研究了交泰丸抗抑郁作用的分子作用机制，发现了交泰丸28个活性成分，这些成分主要参与调控MAPK、Wnt、ErbB信号转导通路及该通路中的相关靶蛋白发挥抗抑郁作用。许律捷等[14]采用网络药理学方法研究复方一枝蒿抗流感的作用机制，研究发现IL-1、RAK3、RT、CLK1、HSD11B1是复方一枝蒿抗流感的核心靶点，进一步通过作用于多条免疫相关通路，参与机体免疫调节进而发挥抗流感作用。综上可知，网络药理学相对于传统实验药理学方法，具有全面系统的特点。因此借助网络药理学挖掘半枝莲的主要活性成分及作用靶点，对于从系统水平阐述半枝莲的活性成分及作用机制具有重要意义，为深入开展半枝莲基础实验研究及指导临床合理用药提供理论基础。 1 材料和方法 1.1 半枝莲化学成分的收集 104个化学成分。本研究通过国内外文献检索和TCMSP数据库检索，收集半枝莲中的化学成分，利用PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm./）和Chemical Book（http://www.chemicalbook.com/）等平台对其分子结构进行确证并采用ChemBioDraw软件绘制分子结构，结果统一保存为“sdf”格式文件。 1.2 活性成分的筛选及潜在靶点预测 半枝莲在临床为口服给药，因此，本研究采用PaDEL-Descriptor软件对化合物的分子描述符进行计算，对小分子化合物的类药性进行分析[17]，筛选出半枝莲中的潜在活性成分。 将活性成分的sdf格式文件导入Pharmmapper数据库进行靶点匹配与预测[18]，提取对接分数较高的前30个靶点，进一步采用Uniprot数据库进行校正与转化操作，获取与活性成分作用的相关蛋白靶点（人源）。 1.3 半枝莲治疗疾病类型分析 在获得上述潜在作用靶点的基础上，将靶蛋白导入CTD数据库（http:///about/）中进行疾病类型的分析，查询基因相关疾病，剔除不含疾病信息的靶点，并根据医学主题词表（MESH）的疾病分类对疾病数据进行归类统计。 1.4 网络构建和分析 整合“1.2”和“1.3”项结果，采用Cytoscape软件中的关联功能（Merge）将筛选出的活性成分、潜在靶点及疾病信息构建一个成分-靶点-疾病三元综合网络[19]。进一步挖掘并提取出与肿瘤疾病相关的活性分子及靶点蛋白，进而生成成分-靶点网络图、靶点-疾病网络图、成分-靶点-肿瘤疾病网络图，并采用软件Cytoscape的插件Network analysis对网络特征进行分析。 1.5 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建 将筛选得到的肿瘤靶点导入在线STRING 10.0软件（http:///）[20]，获取蛋白质相互作用信息。该软件可自动对每一个蛋白质相互作用信息进行打分，分值越高表明蛋白质的相互作用置信度越高。为保证数据的可靠性，本研究选取打分值高于0.7的高置信度的数据，构建由导入基因表所表达产物组成的PPI网络[21]，并采用Cytoscape软件对网络进行可视化处理和分析。 1.6 生物通路分析 2 结果 2.1 半枝莲中的活性成分及对应的潜在靶点信息 半枝莲所含化学成分结构类型有黄酮类、二萜类、挥发油类、甾体类等。按照类药五原则，口服药物必须满足以下特点：①氢键供体数目（以NH和OH键数目之和计）不大于5；②相对分子质量不大于500；③油水分配系数（logP）不大于5；④氢键受体数目不大于10；⑤可旋转键的数量不超过10个。本研究通过TCMSP数据库和文献检索获得 进一步通过PharmMapper平台反向分子对接实验，得到上述活性分子的潜在作用靶点。本研究选取每个成分得分最高（Fit score）的前30个靶点蛋白，经Uniprot进行校正，剔除重复后共预测出半枝莲潜在影响的靶点蛋白共计267个。 2.2 药物-靶点-疾病相互作用网络构建与分析 经过筛选发现，半枝莲的潜在作用疾病共15种，包含细菌感染（bacterial infection）、癌症（cancer）、消化系统疾病（digestive system disease）、泌尿系统疾病（urogenital disease）、呼吸道疾病（respiratory tract disease）、皮肤病（skin disease）、口腔疾病（mouthdisease）、血液系统疾病（blood disease）、代谢性疾病（metabolic disease）、免疫系统疾病（immune system disease）、心血管疾病（cardiovascular disease）、内分泌系统疾病（endocrine system disease）、神经系统疾病（nervous system disease）、耳鼻喉疾病（ear-nose-throat disease）、肌肉骨骼疾病（musculoskeletal disease）。将半枝莲活性成分-作用靶点-疾病之间的相互作用采用cytoscape 3.40构建网络图（图1），其中不同颜色的节点分别代表半枝莲中的活性成分、作用靶点以及对应的疾病类型，边代表活性成分和作用靶点以及靶点和疾病间的相互作用关系。在网络中，一个节点的度（degree）表示和节点相连的路线的条数，度越大，意味着该节点在整个网络中发挥较为重要的作用，点的大小代表了度值的多少，反映了成分、靶点及疾病的重要性。通过网络分析，150个活性成分的267个潜在靶点对应到15种疾病上，表明半枝莲中不同的活性成分可作用于相同的靶点，也可作用于不同的靶点，这体现了其多成分、多靶点的作用特点。在网络中除部分靶点无对应的疾病信息外，每一个靶点至少与一种疾病相关，其中肿瘤的作用靶点较多（度为134），而消化系统疾病、泌尿系统疾病、代谢性疾病等关联的作用靶点次之（度依次为105、90、54），表明半枝莲在肿瘤治疗方面具有潜在优势，从疾病类型看，半枝莲可作用于肝癌、肺癌、胃癌、鼻咽癌、前列腺癌等不同类型的肿瘤。另外对肝硬化、肝炎、胆结石等消化系统疾病，肾炎、肾功能衰竭等泌尿系统疾病及代谢性疾病糖尿病均具有潜在应用价值。而现代临床实践证明半枝莲单方及其复方均可用于上述疾病的治疗，在一定程度上证明本研究策略的可行性。 2.3 半枝莲活性成分-抗肿瘤靶点网络构建与分析 本研究拆解并提取成分-作用靶点-疾病网络图中与肿瘤相关的活性成分及靶蛋白，构建成分-靶点互作关系，以成分-靶点网络表示（图2）。该网络总共包括285个节点（150个化合物节点和135个靶点节点）。进一步分析发现半枝莲有96个活性分子可与14个及以上的靶蛋白相互作用，其中度较高的活性分子多数为二萜类化合物，其次为黄酮类化合物，如临泉半枝莲生物碱D（scutelinquninneD，度＝22）、barbatellarine E（度＝20）、半枝莲二萜H（scutellones H，度＝19）、半枝莲碱A（scutebarbatinesA，度＝19），5-羟基-7,4′-二甲氧基黄酮（5-hydroxy-7,4′-dimethoxyflavone，度＝18）以及黄芩素（baicalein，度＝19）。亦有文献报道半枝莲的活性成分二萜类和黄酮类化合物具有较强的抗肿瘤活性[22]。如黄酮类化合物汉黄芩素（wogonin）可通过作用于缺氧诱导因子1α（HIF-1α）蛋白，抑制肿瘤血管生成[23]，诱导肿瘤细胞凋亡[24]；黄芩素（baicalein）能抑制肿瘤细胞的增殖、转移以及与肺癌相关的炎症[25]。二萜类成分半枝莲碱A（scutebarbatines A）能抑制CD+T细胞和CD8+细胞的激活，通过免疫调节抑制肿瘤生长[26]；半枝莲碱B（scutebarbatines B）能将细胞阻断于G1期，影响细胞的正常分裂；Scutellones能破坏肺癌细胞微丝蛋白聚集功能，还可影响肿瘤细胞的迁移[27]。进一步验证了结果的准确性。 HSP90-α（HSP90AA1） 2.4 半枝莲活性成分-抗肿瘤靶点-肿瘤疾病生物网络的构建及分析 为进一步探究半枝莲治疗不同类型肿瘤的分子靶点-肿瘤疾病生物网络。研究发现，与其他类型的肿瘤疾病相比，半枝莲对前列腺癌（度＝41）、乳腺癌（度＝40）、肝癌（度＝35）、肺癌（度＝34）、胃癌（度＝26）的治疗具有显著的优势，这也与半枝莲功能主治的现代药理学研究相吻合。将上述疾病对应成分及靶点信息导入Cytoscape软件，生成成分-靶点-肿瘤网络图（图4）。结果发现，半枝莲对于不同类型的肿瘤疾病的治疗即有共同的分子作用群及靶点群，又各有偏重。 2.5 半枝莲肿瘤相关靶点PPI网络的构建和分析 为进一步探讨半枝莲发挥抗肿瘤活性作用机制，本研究基于PPI关系，构建了半枝莲潜在靶点的PPI网络（图5）。PPI网络包含118个节点和476条相互作用关系，利用Cytoscape软件对网络拓扑学特征进行分析，发现其中中介中心度数的32.2%。这些关键节点包括TP53、AKT1、MAPK1、MMP9、HRAS、SRC、HSP90AA1等靶蛋白，其中度值最高的为肿瘤抑制蛋白p53（TP53），能与41个蛋白发生相互作用，提示该靶蛋白在整个网络中发挥较为重要的作用。 2.6 生物通路富集分析 PPI网络中38个关键靶蛋白的KEGG通路富集分析结果如图6所示，本研究通过Rich factor、P值富集到通路上的基因个数来衡量KEGG富集 3 讨论 中医认为热毒蕴结是恶性肿瘤发生的重要病因和病理之一，热邪久留体内，血遇热则凝，津液遇火灼为痰，热与痰、瘀等蕴结形成热毒，热毒阻塞于经络脏腑，就可形成肿瘤。《皇帝内经素问·至真要大论》中记载“治热以寒、热者寒之”，对于肿瘤的治疗要用寒冷药物达到清热解毒的目的。因此采用清热解毒药治疗恶性肿瘤是中医治疗肿瘤的主要法则之一[33]。 半枝莲作为一种广泛应用于临床的清热解毒类中药，被应用于多种癌症的辅助治疗[34]。本研究采用网络药理学的方法挖掘半枝莲抗肿瘤的活性成分及作用靶点，通过构建成分-靶点-疾病网络获得半枝莲发挥抗肿瘤活性的活性成分及靶点，并对成分与靶蛋白间的相互作用关系采用成分-靶点网络进行可视化，同时进行蛋白相互作用网络，靶点关联通路分析，从而为半枝莲多成分、多靶点、多途径的抗肿瘤整合作用机制提供参考。 本研究结果发现半枝莲作用的关键靶点包括PTP1B、CDK2、HSP90AA1等，其中PTP1B是一种经典的非跨膜性蛋白酪氨酸磷酸酶，其主要通过调节细胞内酪氨酸的磷酸化水平来调控细胞的生长、分化、代谢、迁移、基因转录及凋亡，在细胞增殖和信号传导的调节过程中起着重要作用。相关研究发现PTP1B在乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤组织和细胞中高表达，并有能促进肿瘤细胞转移的作用[35-36]。已有研究发现从中药中分离得到的部分黄酮类成分和二萜类成分具有很好的PTP1B抑制活性[37]，然而关于半枝莲对靶蛋白PTP1B的调控还尚未见报道，需深入研究。CDK2是CDKs家族成员之一，是细胞周期G1期和S期中重要的调控因子[38]。越来越多的研究表明细胞周期调控异常与细胞癌变密切相关，在90%以上的人肿瘤中，CDKs都有过度表达[39]，Marconett等[40]采用PI染色流式细胞仪研究发现半枝莲提取物可抑制肺癌MCF7细胞增殖，阻滞细胞周期于G1期，并可降低cyclinD1、CDK2、CDK4的表达，进一步验证了预测的正确性。HSP90AA1编码的热休克蛋白90α作为热休克蛋白家族中的重要一员，能维持多种致瘤配体蛋白的构造稳定性及功能，在肿瘤细胞的分化和增殖、生存和移动、血管形成和转移中起作用。HSP90已成为公认的抗癌治疗的靶蛋白[41]。Fu等[42]研究发现半枝莲所含的木犀草素能降低STAT3的Tyr705和Ser727磷酸化进而引诱肿瘤细胞的凋亡与对靶蛋白疾病网络分析，可以获得成分-靶点-疾病的关系，特别是不同类型肿瘤的关联靶点及成分，可在后期不同肿瘤研究中，选取合适的成分及靶点通路进行分析，更有效地揭示作用机制。 为进一步探讨半枝莲调节的生物通路，本研究对PPI网络中出现的蛋白进行KEGG通路富集分析，发现PPI网络的关键靶点主要富集于3个通路：VEGF信号通路、FcεRI信号通路和FoxO信号通路。恶性肿瘤的生长、转移、复发依赖于新生血管的形成观点已达共识，肿瘤血管生成的过程受多种生成因子调控，研究发现VEGF信号通路与肿瘤新生血管有着密不可分的关系，其中VEGF家族及其受体是作用最强的正性调控因子之一，在肿瘤血管中呈高表达状态。张妮娜等[44]采用Matrigel栓和原代人脐静脉内皮细胞建立血管生成模型发现半枝莲在体内外均能抑制肿瘤血管的生成，并且能显著抑制肿瘤细胞分泌VEGF蛋白表达，从实验角度证明半枝莲可通过调控VEGF信号通路影响血管内皮细胞增殖、生长、迁移及血管通透性的增加，抑制血管的生成进而发挥抑制肿瘤的生长和转移。FoxO信号通路在细胞凋亡过程中发挥着非常重要的作用，参与多种肿瘤的发生和发展。FoxO家族是P13K/ Akt信号通路下游的重要信号分子，可通过Akt磷酸化和去磷酸化调节其活性以及下游信号分子如细胞死亡调节因子（Bcl-2interacting mediator of cell death，Bim）、Fas配体和细胞周期蛋白依赖性激酶等转录作用，诱导细胞凋亡。已有较多的研究证明半枝莲能诱导多种肿瘤细胞的凋亡，可能与FoxO信号通路有关[45-47]。静广平等[47]研究发现半枝莲提取物（ESB）可通过调控apoptosis信号通路中多个基因如Bcl-2、Bax、Caspase-3从而降低舌鳞癌SAS细胞的增殖力。张梅等[48]研究发现半枝莲可通过诱导细胞凋亡作用抑制人肺癌A549细胞的生长，其分子机制可能与下调Survivin表达水平和上调Caspase-3的表达水平有关。此外，本研究发现炎症相关通路FcεRI信号通路在半枝莲治疗恶性肿瘤的过程中可能发挥重要作用。近年来研究表明，恶性肿瘤的生长不仅受肿瘤细胞自身遗传学和生物学的调控，而且还受肿瘤微环境的影响，而炎症被认为是其中最重要的因素之一。在肿瘤炎症环境中，募集的炎症免疫细胞不仅通过表型的转换和修饰参与免疫抑制微环境的形成，而且通过输送炎症因子促进肿瘤的增殖和转移。半枝莲具有抗炎作用，有研究[49]发现半枝莲提取物可以显著抑制HT-29人结肠癌细胞中由促炎因子IL-6介导的STAT3磷酸化水平和转录活性的升高，从而抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。因此，推测半枝莲可通过调控FcεRI通路介导的信号转导，抑制肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放炎性介质和细胞因子进而间接抑制肿瘤细胞的生长，具有潜在的研究价值。 综上所述，本研究应用网络药理学方法，对半枝莲多成分、多靶点、多途径的复杂网络关系进行研究，发现半枝莲抗肿瘤的主要活性成分为包括半枝莲临泉生物碱D、barbatellarineE、半枝莲碱A等在内的二萜类成分，其次为5-羟基-7,4′-二甲氧基黄酮、黄芩素等黄酮类成分。这些组分既能通过直接调节肿瘤细胞分化、生长、增殖和凋亡，达到抑瘤效果；同时也能通过抗炎、抑制肿瘤血管生成等间接提高抗肿瘤的功效。本研究为进一步深入探讨其作用机制奠定了良好的基础。 参考文献（略） 来 源：杨 沙，段灿灿，晏仁义，张建永. 基于网络药理学的半枝莲抗肿瘤活性成分及整合作用机制研究 [J]. 中草药, 2018, 49(15):3471-3482. |
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