CTC分离，方法您选对了吗？

      CTC（循环肿瘤细胞，Circulating Tumor Cell）是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶（原发灶、转移灶）脱落，大部分CTC在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者死亡风险。CTC代表的是完整的、有活性的细胞，科学家可以提取DNA、RNA、蛋白质，进行不同层次水平的检测，更加完整的实时监测肿瘤动态、评估治疗效果，实现个体化治疗。

CTC有哪些特点？

1. 稀有性：每10mL血液中可能仅含有几个到几十个循环肿瘤细胞。

2. 非典型性的细胞形态：一般比血液细胞，正常组织细胞体积大；细胞核大，不规则，细胞核质比高；不易发生变形。

3. 异质性：细胞表面抗原标志物表达差异；携带不同的分子信息；转移潜力差异。

4. 不同形态和类别：CTC可以是间质型、上皮型或者上皮间质混合型，CTC也既可以是单个细胞的CTC也可以是成团的CTCs。

目前CTC分离的方法

       目前市面上CTC富集的方法主要有两种：生物富集法和物理富集法。前者主要是基于肿瘤细胞表面特异性表达的marker，利用磁珠结合的抗体进行阳性富集或阴性富集，也可采用流式细胞分析仪进行分选。后者主要基于细胞的直径进行富集，比如使用直径为8微米的滤膜过滤去除白细胞分离CTC。

       今天小编给大家介绍的是基于生物富集+显微成像挑选两步法进行CTC的分离。目前已经有研究者使用该方法成功进行胰腺癌、乳腺癌和胃食管癌CTC的分离。

       在2017年Lapin等发表的文章中，作者以21位胰腺癌患者的56份血样作为研究对象，首先使用密度梯度离心的方法获得单核细胞，然后用链霉亲和素结合的beads与标记了生物素结合的CD45、CD16、CD19、CD163以及CD235/GYPA抗体的细胞进行孵育，去除beads结合的单核细胞和残留的红细胞，未结合beads的细胞即富集好的可能含有胰腺癌CTC的细胞。

       作者又将这些细胞进行了Hoechst、EpCAM、MCAM以及CD45抗体的标记，置于MMI的CellEctor单细胞挑选系统上面，基于荧光显微成像，按照细胞核可见/无beads结合/表达EpCAM-MCAM/不表达CD45/细胞圆形或卵圆形的标准在荧光显微成像下圈选出细胞，CellEctor自动化实现纯的特异性的胰腺癌CTC的分离。作者以此单细胞进行了下游的单细胞RT-PCR，分析了包括EpCAM在内的13个marker。最终结果指示胰腺癌CTC的上皮样分子以及间充质样分子表达与其它淋巴细胞不同，癌症干细胞(CSC)marker以及胞外基质蛋白(ECM)表达有明显的升高。这项研究是基于单个的胰腺癌CTC，研究结果对于揭示与CTC向远端器官转移并定位相关的转录本以及上皮样CTC预示更好的癌症患者存活率具有重要的理论指导意义。

如上图所示：蓝色的Hoechst指示细胞核，绿色的EpCAM/MCAM指示胞膜，红色的CD45指示淋巴细胞，最后一列Merge指示完整的CTC。

       在2013年M Pizon等、2011年Hjortland等发表的文章中，均使用了类似的方法分别从乳腺癌患者、胃食管癌患者体内分离出CTC进行基因表达、体外培养监测肿瘤球形成的能力、全基因组CGH芯片分析等，为个体化治疗提供了有力的理论依据。

       基于免疫磁珠富集+显微成像可视化单细胞挑选两步法进行CTC的分离已经是非常成熟的方法，以往的研究证实了这是一种高效的、能较好维持细胞活性的特异性获得纯的CTC的方法。其中第二步中使用到的CellEctor是德国MMI公司专门针对CTC、干细胞等罕见细胞设计的基于毛细管原理的单细胞挑选系统。该系统以高性能的自动倒置显微镜为平台，搭载高精度电动载物台，通过高精度CellPump简单、精准地实现CTC、干细胞及其它罕见细胞的识别、吸取及转移。

参考文献：

1. Barbara,et al. Single-cell analysis of CTCs with diagnostic precision: opportunities and challenges for personalized medicine. Expert Rev. Mol. Diagn. (2016) 16(1), 25–38

2. Lapin,et al. Single-cell mRNA profiling reveals transcriptional heterogeneity among pancreatic circulating tumour cells. BMC Cancer (2017) 17:390

3. M Pison,et al. Heterogeneity of circulating epithelial tumour cells from individual patients with respect to expression profiles and clonal growth (sphere formation) in breast cancer. ecancer (2013), 7:343

4. Geir Olav Hjortland,et al. Genome wide single cell analysis of chemotherapy resistant metastatic cells in a case of gastroesophageal adenocarcinoma. BMC Cancer (2011), 11:455 

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