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经典名方芍药甘草汤的 物质基准量值传递分析 唐晓章1,2，林美斯3，周菲1,2， 王琳1，李圆圆2，唐建军2， 林大胜1,2通信作者，高星2通信作者 （1.成都中医药大学 药学院，西南特色中药资源重点实验室，成都 611137；2.成都泰合健康科技集团股份有限公司，成都 611731；3.成都中医药大学 附属医院 针灸学校，成都 610097） 芍药甘草汤源自于东汉·张仲景《伤寒论·辨太阳病脉证并治》，由白芍与甘草2味药材组成，具有柔肝舒筋、缓急止痛之功效，主治伤寒伤阴、筋脉失濡、腿脚挛急、心烦、微恶寒、肝脾不和、脘腹疼痛。芍药甘草汤具有丰富的临床应用基础，是国家中医药管理局发布的《古代经典名方目录（第一批）》所载方剂之一。现代研究表明，该复方在神经系统、消化系统、免疫系统等方面都具有很好的治疗作用。 2017年10月，国家食品药品监督管理总局在《中药经典名方复方制剂标准煎液的申报资料要求（征求意见稿）》中，提出关于药材、饮片与物质基准之间主要物质群量值传递研究的概念，为经典名方物质基准量值传递的研究奠定了基础。2018年5月，国家药品监督管理局发布《古代经典名方中药复方制剂简化注册审批管理规定》，指出“经典名方物质基准”是以古代医籍中记载的制备方法为依据制备而得的中药药用物质标准，也是衡量制剂与中医临床所使用的药用物质是否一致的标准，该规定为经典名方的开发和利用提供政策支持，有利于促进中医药的现代化发展。随着国家相关政策出台，经典名方研究如雨后春笋，一些指导性建议和研发思路相继提出，为经典名方研究开发奠定了良好基础。 目前，关于芍药甘草汤的研究多集中于药材、饮片及汤剂指纹图谱等方面，为该复方的质量评价提供了一定的参考信息，但关于其药材-饮片-物质基准之间的量值传递研究尚未见文献报道。近年来，量值传递研究与指纹图谱研究相结合的新模式在中药新药领域的应用已有文献报道，但并未与制备过程中的技术经济指标评价相结合。物质基准的研究对于经典名方药物的开发至关重要。本实验拟建立同时适合于芍药甘草汤药材、饮片、物质基准的指纹图谱检测方法，进行该方制备工艺过程中主要物质群量值传递研究，并结合制备过程中技术经济指标，以评价芍药甘草汤物质基准制备工艺的科学性与合理性，为经典名方物质基准的研究提供借鉴。 1 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司，含ChemStation色谱工作站），XS205DU型1/10万电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司），PCDX-JB-10型超纯水机（成都品成科技有限公司）。芍药苷、甘草苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为110736-201741，111610-201607，纯度依次为95.7%，93.1%），异甘草素、甘草素、异甘草苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、甘草酸对照品（英国PureChemLand公司，批号分别为PCL-#-1S712，PCL-#-L/746，PCL-#-1S713，PCL-#-P860，PCL-#-P859，PCL-#-Ga293，纯度依次为99.85%，99.04%，99.42%，98.59%，98.77%，99.27%），水为超纯水，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。白芍与甘草2味药材购自不同产地，见表1，经四川省药品质量研究所主任药师黎跃成鉴定，分别为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora的干燥根和豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis的干燥根及根茎，均符合2015年版《中国药典》的相关规定；15批白芍饮片、炒甘草饮片、芍药甘草汤物质基准样品均为实验室自制。 2 2.1 HPLC指纹图谱检测方法的建立 2.1.1物质基准供试品溶液的制备 取白芍饮片、甘草饮片各约12 g，加水600 mL浸泡30 min，加热至沸腾，转中火，保持沸腾，煮至300 mL，趁热过滤，减压浓缩，冻干，即得芍药甘草汤物质基准样品。取该样品约0.2 g，精密称定，置于100 mL量瓶中，加70%甲醇超声使溶解并定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。 2.1.2药材与饮片供试品溶液的制备 取白芍、甘草药材及饮片各约12 g，分别加水600 mL，按2.1.1项下方法分别制备白芍、甘草药材及饮片的供试品溶液。 2.1.3对照品溶液的制备 取甘草苷、芍药苷、异甘草素、甘草素、异甘草苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、甘草酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为38.32，39.08，40.02，41.68，40.13，40.50，39.82，40.94 mg·L-1的混合对照品溶液。 2.1.4色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B）梯度洗脱（0~10 min，10%~20%A；10~18 min，20%A；18~19 min，20%~23%A；19~35 min，23%~38%A；35~40 min，38%~41%A；40~45 min，41%~45%A；45~48 min，45%~100%A；48~50 min，100%~10%A；50~55 min，10%A），流速1.0 mL·min-1，柱温30 ℃，检测波长237 nm，进样量10 μL。 2.1.5精密度 取物质基准供试品溶液1份，按2.1.4项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。以8号色谱峰（甘草苷）为参照峰，计算共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD均≤5.0%，表明仪器精密度良好。 2.1.6重复性 取同批物质基准供试品溶液6份，按2.1.4项下色谱条件测定，记录色谱图。以8号色谱峰（甘草苷）为参照峰，计算共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD均≤5.0 %，表明该方法重复性良好。 2.1.7稳定性 取2.1.1项下方法制备的物质基准供试品溶液1份，分别在制备后0，4，8，12，24，48 h按2.1.4项下色谱条件测定，记录色谱图。以8号色谱峰（甘草苷）为参照峰，计算共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD均≤5.0%，表明物质基准供试品溶液在48 h内稳定性良好。 2.1.8样品测定 分别精密吸取甘草药材、甘草饮片、白芍药材、白芍饮片及物质基准的供试品溶液适量，按2.1.4项下色谱条件测定，记录色谱图至54 min。 2.2指纹图谱检测及物质群量值传递相关性分析 2.2.1指纹图谱的检测及相似度评价 分别将15批甘草药材、甘草饮片、白芍药材、白芍饮片及芍药甘草汤物质基准色谱图数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012版）软件，设置参照图谱，自动匹配，采用均值法生成指纹图谱与对照指纹图谱，见图1~3。在白芍药材与白芍饮片的指纹图谱中，以芍药苷为参比峰；在甘草药材、甘草饮片、物质基准的指纹图谱中，甘草苷色谱峰的保留时间居中、分离度良好、峰面积较大且为甘草的主要活性成分之一，故确定以甘草苷（8号峰）为参比峰，并分别以芍药苷与甘草苷的相对保留时间（RRT）和相对峰面积（RPA）为基准，标定了共有峰（甘草药材11个、甘草饮片11个、白芍药材6个、白芍饮片6个、物质基准16个），计算各共有峰的RRT和RPA，见表2；采用自动匹配模式计算相似度，见表3。结果发现15批甘草药材、白芍药材指纹图谱与二者各自生成的对照指纹图谱的相似度分别为0.900~0.999，0.951~0.997，说明产地对药材主要物质群的影响较小；15批甘草饮片、白芍饮片指纹图谱与二者各自生成的对照指纹图谱的相似度分别为0.919~0.999，0.980~1.000，说明炮制方法对饮片物质群差异不会造成较大影响。15批芍药甘草汤物质基准指纹图谱与其生成的对照指纹图谱的相似度处于0.902~0.993，说明制备工艺稳定，物质群批间差异小。 2.2.2指纹图谱共有峰的归属 对芍药甘草汤物质基准中各共有峰进行药材归属分析，见图3。物质基准中的2，5，6，9，14号色谱峰归属于白芍药材及饮片；3，4，7，8，10，11，12，13，15，16号色谱峰归属于甘草药材及饮片，并对7个色谱峰进行了指认，5，6，8，12~14，16号色谱峰分别为芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、异甘草苷、甘草素、苯甲酰芍药苷、甘草酸，主要药效物质群的指认率43.75%。说明芍药甘草汤物质基准的物质群均可清晰地追溯到药材，色谱峰归属明确，且指认率较高。 2.2.3物质群量值传递的相关性分析 对芍药甘草汤药材、饮片与物质基准制备过程中物质群的量值传递进行相关性分析，见图2，3。结果表明白芍药材主要物质群（6个共有色谱峰）和甘草药材主要物质群（11个共有色谱峰）均完整地传递到饮片，且各药材与其饮片的对照指纹图谱相似度分别为0.960和0.990，说明炮制方法未造成药材主要物质群丢失。芍药甘草汤物质基准共有特征峰16个，其中6个色谱峰来自于白芍，占白芍饮片总峰面积约95%，占物质基准总峰面积约42.48%；其中11个色谱峰来自于甘草，占甘草饮片总峰面积约95%，占物质基准总峰面积约48.53%；说明芍药甘草汤物质基准制备工艺未造成饮片主要物质群丢失。提示芍药甘草汤物质基准主要药效物质群从药材-饮片-物质基准能逐级完整传递，几乎无损失，且归属关系清晰。 2.3出膏率及有效成分转移率的考察 2.3.1出膏率 按2.1.1项下制备芍药甘草汤物质基准样品，测定15批物质基准样品的出膏率，计算公式为出膏率=m/M×100%，式中m表示物质基准样品的质量，M表示饮片投料量，见表4。结果表明15批物质基准的出膏率平均值24.81%，RSD 7.4%，均未出现离散数据（平均值的70%~130%以外）。 2.3.2有效成分转移率 按2015年版《中国药典》（一部）含量测定与2.1.4项下色谱条件分别测定各样品中有效成分含量，按公式转移率=（w×m）/（W×M）×100%计算芍药苷、甘草苷及甘草酸的转移率，式中w表示物质基准中有效成分的质量分数，m表示物质基准样品量，W表示饮片中有效成分的质量分数，M表示饮片投料量，见表4。结果芍药苷、甘草苷及甘草酸从饮片到物质基准的转移率平均值分别为79.68%，63.70%，51.20%，RSD分别为9.1%，11.1%，9.9%，均未出现离散数据（平均值的70%~130%以外）。说明芍药甘草汤物质基准制备过程的出膏率波动不大，未出现离散数据；主要药效物质芍药苷、甘草苷及甘草酸有效成分转移率较高，且基本稳定，未出现离散数据。暂定出膏率处于17.37%~32.25%；芍药苷、甘草苷及甘草酸的转移率分别处于55.78%~103.58%，44.59%~82.81%，35.84%~66.56%。 3 经典名方物质基准是指以古代医籍中记载的古代经典名方制备方法为依据制备而得的中药药用物质的标准，除成型工艺外，其余制备方法应当与古代医籍记载基本一致，经典名方制剂的关键质量属性应与经典名方物质基准确定的关键质量属性一致，其作用近乎于标准物质。因此，经典名方物质基准的研究，除采用质量源于设计（QbD）的理念外，应该以古代医籍记载的制备方法为依据，以主要药效物质群研究为基础，以药材-饮片-物质基准主要物质群量值传递研究为核心，以物质基准制备过程的有效成分转移率、出膏率或收率等技术经济指标评价为支撑，进行系统设计、深入研究、科学评价。 经典名方物质基准的研究是经典名方制剂成功开发的关键环节。基于古代医籍中记载的制备方法，制备经典名方物质基准时应注意以下几点：①由于产地、环境气候、采收时间等因素，药材的批间质量一致性容易受到影响，不利于物质基准的质量控制，因此应选择道地产区或经中药材生产质量管理规范（GAP）认证的生产基地的药材，确保选取药材的来源和质量稳定；②质量差异较大的合格饮片，以传统煎煮工艺制备物质基准时，容易导致物质基准的一致性差，为保证经典名方物质基准的均一、稳定，可参考文献中提出的建议进行处理，即均匀混批，以保障投料饮片的质量均匀性和一致性；③经典名方物质基准应采用整体质量控制的思路和方法，保证物质基准制备工艺具备的科学性、合理性。本研究采用整体物质群控制的指纹图谱方法、制备工艺过程中物质群量值传递研究与制备过程中技术经济指标评价相结合的研究模式，整体说明了本实验设计的芍药甘草汤物质基准制备工艺具备较好的科学性与合理性。 芍药甘草汤是由白芍与甘草组成的小复方，但其化学成分复杂。在经典名方的研发过程中，要建立同时适合于药材-饮片-物质基准的指纹图谱检测方法，难度较大。由于白芍与甘草的主要色谱峰（芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷等）比较集中，分离度较难。因此，本课题组主要针对检测波长、流动相系统、梯度洗脱程序等色谱条件进行考察和反复研究，最终建立的指纹图谱检测方法不仅能较为全面地反映药材、饮片与物质基准的物质群信息，且指纹图谱基线平稳，主要色谱峰分离较好。该方法的建立为芍药甘草汤药材-饮片-物质基准药效物质群的量值传递研究奠定了坚实的基础。后续将采用该方法对经典名方制剂进行全面系统的工艺与质量控制研究，并结合制备过程中的技术经济指标，深入研究药材-饮片-物质基准-经典名方制剂主要药效物质群的量值传递关系。 原文连接： http://kns.cnki.net/KCMS/detail/11.3495.R.20190116.0925.001.html 版权声明：本文来源于《中国实验方剂学杂志》网络首发日期：2019-01-17。中药大品种联盟（BBTCML）获授权编校发布。编辑：远志。转载请标注作者及出处。 |
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