转录本定量一般有两种方式，一个是基于比对定量（如RSEM、eXpress）；另一种是不基于比对的方法（转录本划分成kmer, 用kmer出现的次数来衡量转录本丰度，如kallisto、salmon，优点就是快）
注意一 ：如果自己有多组数据（例如同一物种的不同组织），最好先全部拼接成一个转录本，然后再分开进行定量
注意二 ：Trinity软件虽然可以调用RSEM、eXpress等，但是并不是内置，还是需要我们自己先手动安装好，放入环境变量；或者直接conda安装
Trinity为了定量，推出了一个脚本align_and_estimate_abundance.pl
帮助文档很详细，需要注意的就是： 尽量使用--samples_file这个参数，因为它会将不同的处理及重复的结果文件自动放入不同的目录；--prep_reference这个参数是很有帮助的，它先对拼接的转录本构建索引，然后再对不同样本进行并行计算表达量，可以视作一个提速的手段；--trinity_mode或者--gene_trans_map除了得到isoform的表达矩阵，还可以得到gene层面的表达矩阵【前面提到过，拼接的转录本中一个gene对应多个isoform】
怎么定量？ 基于比对的模式生成的结果中会有FPKM（fragments per kilobase transcript length per million fragments mapped）、TPM（transcripts per million transcripts）两种标准化方法；不基于比对的结果只有TPM。
所谓的标准化就是：去除测序深度 和基因长度的 的影响
这两种哪种更合理呢？关于FPKM和TPM之争，许多文章都有介绍：Wagner et al. 2012. Theory Biosci ， Li and Dewey, BMC Bioinf. 2011. 目前一般都推荐TPM
首先，回归主要问题：定量 。我们来看看什么是表达量？
如果要明确知道一个细胞中、或者是一定摩尔量的 RNA中，有多少条某种转录本，就是绝对定量 （如果能够对样品进行细胞计数或者添加 spike-in, 转录组也可以实现绝对定量）
但我们平时做的转录组测序，要求并没那么高，并不知道用于建库测序的 RNA 来自多少个细胞，总共有多少转录本。因此只能相对定量 ，也就是描述某基因的转录本占样本中所有转录本的百分比。
好了，前面说的定量就是统计的read count数 （下图左一），但是这还并不能说明真实情况，因为没有考虑长度的分布（比如下图的3和4：在read count总数中确实4比3要多许多，但是注意观察，3是两段短的转录本，4是一个长一短。有没有注意到，其实3和4的read分布是一个水平的，它们都很均匀，和1相比1就显得比较稀疏）。为了更好了了解表达量（Expression）和片段数（read count）的差别，我们再来看看下面图中的2和4，总量的话（左一）2和4是一样的，但是2明显每个转录本分布的reads更多，因此换算到表达量时，2的表达量要比4高不少（右一）
raw-count and expression 上面知道了要同时考虑raw count和转录本长度的影响 ，因此就需要公式来进行标准化，公式很多，那么哪一种更能反映真实问题呢？
对比 对公式不清楚的话，其实简单看发表年份就能知道，TPM比FPKM更先进一些
下面具体从公式角度了解，看看两种方法的计算公式：
TPMvsFPKM Xi表示比对到某基因上的Fragment数目，单位是Millions Fragments；Li表示这个基因外显子的长度，单位是Kilobase。因此Xi/Li 的商就是外显子长度为1Kb的基因Fragment数目，即转录本丰度 ，因此TPM可以校正转录本长度分布的影响，用于可以更好地进行样本间比较。
【注意，二者分母不同，TPM的分母中考虑了长度的影响，可以理解成总的转录本丰度；而FPKM中，没有考虑长度影响，可以理解成总的Fragment数目】
如果对每个样品总 表达量求和，会发现 TPM中各个样本的总和是相等的，而FPKM则不相等。因此，能用TPM就不用FPKM
注意最后加和 【目前DESeq2和edgeR不用RPKM/FPKM或TPM做均一化，而是直接用原始的read counts做均一化处理】
参考：https://haroldpimentel./2014/05/08/what-the-fpkm-a-review-rna-seq-expression-units/
https://www./watch?v=TTUrtCY2k-w
定量结果都有啥？ 基于比对的定量 比对过程会产生bowtie.bam，这个文件会直接导入RSEM或eXpress，如果定量时选择--coordsort_bam参数，会对bam文件进行sort，生成一个bowtie.csorted.bam文件，为了方便IGV可视化
RSEM（RNA-Seq by Expectation Maximization）：结果生成两个文件，均包含定量信息：
结果产生两个文件RSEM .isoforms .results : 每个拼接转录本的最大期望count 数[见下表] RSEM .genes .results : 一个基因对应多个转录本(此处基因非严格意义上的基因)，统计了每个'基因“的最大期望count 数
transcript_id gene_id length effective_length expected_count TPM FPKM IsoPct TRINITY_DN100_c0_g1_i1 TRINITY_DN100_c0_g1 443 181.37 4.84 1670.06 12311.85 100.00 TRINITY_DN101_c0_g1_i1 TRINITY_DN101_c0_g1 251 19.37 1.00 3231.22 23820.87 100.00 TRINITY_DN103_c0_g1_i1 TRINITY_DN103_c0_g1 1219 957.37 0.00 0.00 0.00 100.00 TRINITY_DN103_c0_g2_i1 TRINITY_DN103_c0_g2 414 152.41 0.00 0.00 0.00 100.00
关于RSEM：https://bmcbioinformatics./articles/10.1186/1471-2105-12-323
eXpress：
结果产生两个文件(10 tab-delimited columns, sorted by the bundle_id)by eXpress)by summing up transcript values per gene)
包含了： estimated counts, FPKM, and TPM 等信息
关于eXpress：https://pachterlab./eXpress/overview.html#top
帮助文档：https://pachterlab./eXpress/manual.html
不基于比对的定量 Kallisto：
结果产生两个文件abundance .tsv : transcript abundance estimates (generated by kallisto )abundance .tsv .genes : gene abundance estimates (provided here by summing up transcript values per gene )
输出结果短小精悍
target_id length eff_length est_counts tpm TRINITY_DN10_c0_g1_i1 334 100.489 13 4186.62 TRINITY_DN11_c0_g1_i1 319 87.9968 0 0 TRINITY_DN12_c0_g1_i1 244 38.2208 2 1693.43 TRINITY_DN17_c0_g1_i1 229 30.2382 5 5351.21
https://pachterlab./kallisto/manual
Salmon：
结果产生两个文件quant .sf : transcript abundance estimates (generated by salmon )quant .sf .genes : gene-level abundance estimates (generated here by summing transcript values )
结果也是很简单
Name Length EffectiveLength TPM NumReads TRINITY_DN10_c0_g1_i1 334 135.084 0 0 TRINITY_DN11_c0_g1_i1 319 120.926 6158.51 13 TRINITY_DN12_c0_g1_i1 244 57.9931 0 0 TRINITY_DN17_c0_g1_i1 229 47.8216 2395.84 2
组合定量结果 因为之前是每个sample生成一个结果文件，现在需要组合在一起，使用abundance_estimates_to_matrix.pl
需要指定的参数： RSEM|eXpress|kallisto|salmon (needs to know what format to expect)需要和之前定量方法一致才能识别并组合 the gene-to-transcript mapping file. (if you don't want gene estimates, indicate 'none'）.
例如：
ls */RSEM.genes.results >genes.quant_files.txt$ TRINITY_HOME/util/abundance_estimates_to_matrix.pl
得到结果
rsem-gene.isoform.counts.matrix : the estimated RNA-Seq fragment counts (raw counts)
其中counts.matrix文件是用来下游差异表达分析的 ， TMM.EXPR.matrix文件是基因表达矩阵
关于TMM的重要性： Robinson & Oshlack, Genome Biology 2010 and [Dillies et al., Brief Bioinf, 2012
