| 【摘要】：目的:通过建立动物缺氧缺血性脑损伤(Hypoxic-ischemia brain damage,HIBD)模型及体外原代皮层细胞氧糖剥夺再灌注(Oxygen and glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)模型,对不同时间点新生大鼠脑组织及原代细胞中自噬发生情况进行分析,探讨在不同自噬干预因素的处理下,增加褪黑素在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤早期线粒体自噬中发挥的作用。方法:将80只7日龄Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为假手术组(Sham组)和模型组(HIBD组)。分别于模型制备完成后0、2、4、6、8、12、24、48h取脑组织,用于Western blot检测线粒体自噬相关蛋白Bnip3及自噬相关蛋白LC3-II表达情况。孕17-19天SD大鼠进行皮层原代细胞培养,JC-1染色检测线粒体膜电位、免疫荧光观察线粒体自噬情况;于OGD/R模型制备后进行自噬抑制剂3-MA、线粒体自噬抑制剂Mdivi-1、自噬激活剂雷帕霉素(Rapamycin,Rapa),以及褪黑素(Melatonin,MT)进行干预,收集细胞检测Bnip3、LC3-II表达情况;CCK8检测细胞活性。TTC染色检测在不同处理因素下脑梗死灶大小。结果:1、脑皮层组织中,与Sham组相比,HIBD组Bnip3于0h即有表达,后续各时间点呈持续高表达状态(P0.05);LC3-II表达从0h开始呈高表达,4h、8h表达明显(P0.05),余时间点较Sham组均有增加(P0.05)。2、原代培养的皮层细胞中,与正常细胞组(Con)相比,OGD/R组Bnip3同样于0h即有表达,且后续各时间点呈持续高表达状态(P0.05);LC3-II表达从0h开始呈高表达,2h有所回落,4h后持续表现高表达状态(P0.05)。3、JC-1线粒体膜电位检测:与Con组相比,OGD/R组线粒体膜电位下降;3-MA及Mdivi-1处理组线粒体膜电位较OGD/R组下降明显(P0.05);Rapa及MT组细胞线粒体膜电位较OGD/R组增加(P0.05)。4、免疫荧光检测线粒体自噬发生情况:Bnip3及LC3标记的抗体均为红色荧光,与Con组比较,OGD/R后原代细胞红色荧光表达数量增加(P0.05),在OGD/R后各药物干预处理组中:3-MA及Mdivi-1组Bnip3及LC3红色荧光表达均减少(P0.05);Rapa及MT组Bnip3及LC3红色荧光数量均明显增加(P0.05)。5、Western Blot结果:Bnip3及LC3-II在3-MA、Mdivi-1中表达均减少,在Rapa组中表达增加,对各药物组追加MT后表达较各药物组均增加。6、CCK8细胞活性检测结果:与Con组相比,OGD/R组细胞活性降低,在OGD/R处理基础上的各药物组存活度中3-MA、Mdivi-1组细胞活性降低(P0.05),Rapa组细胞活性增加不明显(P0.05),MT组细胞活性增加(P0.05),各干预组在进行MT共同干预的情况下细胞活性均增加,除3-MA组外,余差异均有统计学意义(P0.05)。7、TTC染色结果:与Sham组相比,HIBD组可见明显白色梗死灶;3-MA处理组脑梗死面积百分比较HIBD组增加更明显(P0.05),提示3-MA加重脑损伤;Mdivi-1处理组较HIBD组梗死灶面积百分比增加最明显(P0.05),且脑损伤区域波及对侧大脑半球,损伤更严重;Rapa处理组梗死面积百分比较HIBD组稍减少(P0.05);单独MT处理组较HIBD处理组梗死灶面积百分比减轻(P0.05),其与各处理因素同时作用时,梗死灶面积百分比均较各处理组有明显减轻(P0.05)。结论:1.缺氧缺血后新生大鼠皮层组织Bnip3、LC3-II蛋白表达均发生变化,且早期即出现改变,说明无论是自噬还是线粒体自噬在早期脑损伤中发挥重要作用。2.成功进行胎鼠原代皮层细胞培养并进行体外细胞OGD/R模型构建,在细胞层面上对Bnip3、LC3-II的表达情况进行了进一步体外验证。3.3-MA及Mdivi-1在缺氧缺血早期可加重脑组织损伤,在缺氧缺糖早期可使细胞活性降低;MT可以减轻该损伤,可能在脑损伤早期与Rapa具有协同保护作用。4.MT通过增强线粒体自噬的发生,可减轻3-MA、Mdivi-1抑制线粒体自噬后造成的脑损伤,在早期缺氧缺血性脑损伤中发挥着保护作用。 |
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