Fc融合蛋白应用前沿

生物_医药_科研 2019-02-23

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Fc 融合蛋白是指利用基因工程等技术将某种具有生物活性的功能蛋白分子与 Fc 片段融合而产生的新型重组蛋白，其不仅保留了功能蛋白分子的生物学活性，还具有一些抗体的性质，如通过结合相关 Fc 受体延长半衰期和引发抗体依赖细胞介导的细胞毒性效应等。

抗体类药物是当前药物研发的重点和热点，通常能较快获得上市许可，并带来较大的商业成功。进入21 世纪以来，美国 FDA 和欧洲药物管理局（European Medicines Agency，EMA）总共批准了约 20 种抗体类药物。借助传统抗体的成功平台，一种基于抗体结构，将蛋白或多肽与免疫球蛋白 Fc 片段相融合的新功能重组蛋白也获得了一定的发展。

Fc融合蛋白是指利用基因工程等技术将某种具有生物学活性的功能蛋白分子与Fc 片段融合而产生的新型蛋白，功能蛋白可以是能结合内源性受体（或配体）的可溶性配体（或受体）分子或其他需要延长半衰期的活性物质（如细胞因子）。该类融合蛋白不仅保留了功能蛋白分子的生物学活性，并且还具有一些抗体的性质，如长效半衰期。例如，普通重组 IL-2 体内半衰期仅为 6.9 min，而重组 IL-2/Fc 融合蛋白体内循环半衰期则延长了近700倍。

1 Fc 融合蛋白的类别

根据是否需要发挥 Fc 段结合 FcγR 来介导抗体依赖细胞介导的细胞毒性（antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity，ADCC）或结合补体 C1q 来介导补体依赖的细胞毒性（complement-dependent cytotoxicity， CDC）等的生物学活性，可将 Fc 融合蛋白分为溶细胞性（cyto-lytic）和非溶细胞性（non-lytic）。前者由功能性蛋白与天然或活性提高的 Fc 片段融合而成，不仅具有功能蛋白的生物学活性和长效血浆半衰期，并且保留了 Fc 段介导 ADCC 及 CDC 效应的能力，可以靶向杀伤功能蛋白受体阳性细胞。在抗体应用领域，尤其是具有抗肿瘤活性的抗体，通过优化 Fc 段氨基酸组成或糖基化模式等，从而加强由其介导的 ADCC、CDC 等细胞毒活性的研究已经成为一个热点。

非溶细胞性融合蛋白由功能性蛋白与活性降低的Fc 片段融合，通过对 Fc 片段上补体受体结合域或糖基化模式的突变改造，调节 Fc 与相关受体的结合亲和力，降低或消除 ADCC 和 CDC 效应，只保留功能蛋白的生物学活性和 Fc 段长效体内半衰期，而不产生细胞毒性。例如，研究者利用 IgD 和 IgG4 组成的杂合 Fc（hybrid Fc，hyFc）与促红细胞生成素（erythropoietin，EPO融合，构建不能结合 FcγR I 和 C1q，无细胞毒性的长效 EPO-hyFc 分子，其半衰期达到了重组人 EPO——阿法达贝泊汀（darbepoetin alfa）的 2 倍。Vafa 等通过氨基酸替换，微调蛋白三级结构，破坏结合 FcγR和补体的活性，构建能够完全消除免疫效应功能，但能够正常结合新生儿 Fc 受体（neonatal Fc receptor， FcRn），保持比 IgG2 更长循环血浆半衰期的 IgG2-Fc 突变体。Hristodorov 等通过比较 6 种去糖基化的hIgG 单抗和它们的糖基化物的理化性质和抗原结合力等，发现去糖基化的 IgG1 单抗具有与糖基化物相似的功能，并且由于前者引发免疫效应的能力降低，从而更适用于作为治疗慢性疾病药物的融合伴侣。

2 Fc 融合蛋白理化性质和生物学活性的影响因素

Fc 融合蛋白的 2 个组成部分，通常具有相对独立的结构域和功能，能够从不同的角度影响该类分子的理化性质和生物学活性。

2.1 Fc 结构域

Fc 融合蛋白的重要特点是包含 Fc 片段，同时，这也是影响其理化性质和生物学活性的关键因素。

抗体类药物往往具有较长的血浆半衰期，人体内源性免疫球蛋白在 FcRn 的保护下，血浆半衰期能达到 19 d。Fc 融合蛋白含有的 Fc 片段也能够通过类似的原理延长其半衰期，即 Fc 片段通过 CH2-CH3 与 FcRn 结合并呈 pH 依赖性：在 pH 7.4 的生理条件下，FcRn 与Fc 不结合；在细胞内涵体 pH 6.0~6.5 的酸性条件下，两者结合，从而避免融合分子在细胞内被溶酶体等快速降解。同时，融合 Fc 片段能够增大分子体积，降低肾清除率。当然，还可以通过基因工程手段对 Fc 段的氨基酸序列进行突变，获得半衰期更长的突变型融合蛋白。如阿斯利康的 Motavizumab-YTE 突变体的 Fc 段包含了 3 个突变：“YTE”，即 252、254 和 256 位的蛋氨酸（Met，M）、丝氨酸（Ser，S）和苏氨酸（Thr，T）分别被酪氨酸（Tyr，Y）、T 和谷氨酸（Glu，E）替换，Ⅰ期临床研究证实本品在健康人体内的血浆半衰期达到100 d，约为 Motavizumab 原型的 2~4 倍，而清除率仅为原型的 71%~86%。“YTE”这一突变技术将有望应用于其他抗体的优化，从而提高半衰期，减少给药频率。

除了长效性，Fc 片段还能提高分子的稳定性。Fc融合蛋白可以通过 Fc 铰链区的二硫键连接形成稳定的二聚体，进一步通过对二硫键的基因工程改造和修饰，还可以使 Fc 融合蛋白聚集成六聚体复合物。Fc 区域可以独立折叠，保证伴侣分子体内外的稳定性。研究发现，与 Fc 进行融合能够提高蛋白在哺乳动物细胞内的表达，另一方面 Fc 片段可以与 Protein A 亲和柱特异性结合，简化 Fc 融合蛋白的纯化步骤，这在相关生物制品的研发过程中具有重要的意义。

不同 Fc 片段能够特异性地结合体内相关 Fc 受体（FcR），并发挥相应的生物学功能（见表 1），Fc片段结合 FcR 发挥的生物学功能主要有以下 3 类。

1）结合免疫细胞表面的激活性或抑制性受体，正向或负向调节免疫反应。激活性受体（如 FcγR Ⅱ A等）的胞浆区含有免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptortyrosine-based activation motifs，ITAM），而抑制性受体（如FcγRⅡB等）胞浆区则含有抑制性基序（immunoreceptor tyrosine-basedinhibitory motifs，ITIM），分别起到活化和抑制免疫效应的作用。

2）作为免疫复合物一部分，协助免疫细胞摄取抗原。如 FcγR 介导的抗原摄取能够加强树突状细胞递呈抗原和激活 CD4+ 和CD8+ T 细胞的能力。

3）参与免疫球蛋白的运输，如 IgG 与 FcRn 的结合。

2.2 功能蛋白

虽然对 Fc 片段的改造会影响 Fc 融合蛋白的理化性质和生物学活性，但其药理活性还是主要取决于功能蛋白部分。功能蛋白应能特异性地结合某个靶点分子。例如，能够结合肿瘤坏死因子（TNF）并拮抗其作用的上市药物有：TNF 全长抗体（如 infliximab、adalimumab 和golimumab），PEG 修饰的Fab（如 certolizumab pegol）和TNFR-Fc融合蛋白（如etanercept）。靶点为VEGF的药物有：VEGF人源化抗体（如 bevacizumab），衍生自bevacizumab的Fab（如 ranibizumab）和VEGFR-Fc融合蛋白（如 aflibercept）。此外，人抗白介素-1β单克隆抗体（如canakinumab）、重组IL-1R（如anakinra）和 IL-1R/Fc 融合蛋白（如 rinolacept）均能与 IL-1 相结合。

对功能蛋白性质的优化，也将对整个融合分子产生积极影响。胰高血糖素样肽 -1（GLP-1）可通过多种机制明显改善 2 型糖尿病患者血糖情况，但是内源性 GLP-1 极易被体内的二肽基肽酶 - Ⅳ（DPP-IV）降解，血浆半衰期不足 2 min，必须持续静脉滴注或皮下注射才能产生疗效，大大限制了其临床应用。礼来公司新研发的 GLP-1/Fc 融合蛋白——dulaglutide，通过融合 hIgG4-Fc 达到降低免疫原性、减少肾清除率和延长半衰期的目的，同时还将 GLP-1 改造为耐受 DPP-IV 的 GLP-1 酰胺类似物，在保证活性的前提下，进一步提高了分子的稳定性。

3 Fc 融合蛋白类药物

1989 年，Capon 等首次在《自然》（Nature ）上报了一种能够结合 HIV 囊膜蛋白 gp120，阻碍 HIV-1 感染 T细胞和单核细胞的 CD4-Fc 融合蛋白，此后，基于抗体Fc 段的 Fc 融合蛋白的研究和开发在世界范围内得到了迅速的发展。

3.1 已上市药物

2012 年，阿达木单抗（通用名：adalimumab，商品名：Humira）、英夫利昔单抗（通用名：infliximab，商品名：Remicade）和依那西普（通用名：etanercept，商品名：Enbrel）这 3 种治疗自身免疫性疾病的抗体类药物分别以 92.65、82.15 和 79.63 亿美元的全球销售额荣登当年最畅销药品榜单前三甲。作为最成功的 Fc 融合蛋白药物， Enbrel 在 2013 年的全球销售额也达到了 46.81 亿美元，超过了除 Humira 之外的其他单抗类药物。

目前，由 FDA 批准上市的 Fc 融合蛋白类药物主要有7 种（见表 2），均由重组内源性多肽或其突变体与 Fc 片段融合而成，大多数涉及自身免疫性疾病的治疗；在表达方式上，除了 romiplostim 由大肠杆菌进行原核表达，其余均由哺乳动物细胞表达。由于原核表达缺少真核转录后的蛋白修饰过程，酵母、昆虫和植物细胞表达系统的转录后加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同，且表达的蛋白在糖链的结构和组分上与哺乳动物表达系统表达的蛋白有所差异。鉴于糖基化作用对于抗体类药物的重要意义，为了获得蛋白折叠、理化性质和生物学活性等方面更接近于天然状态的的蛋白分子，利用哺乳动物细胞表达 Fc 融合蛋白已经成为一种趋势。

3.2 临床在研药物

除了已经上市的 Fc 融合蛋白类药物，目前还有很多在研药物已经进入了Ⅱ期和Ⅲ期临床研究阶段（见表 3）。

Amgen 公司的 trebananib 能够通过结合血管紧张素 1和 2，抑制两者与 Tie2 受体的结合，从而抑制因血管增生导致的肿瘤恶化，该药物目前正在进行Ⅲ期临床试验，包括 TRINOVA-1、TRINOVA-2、TRINOVA-3 共 3 个部分，其中第一部分的研究结果已于 2013年6月在Amgen 公司官网上发布。

Biogen Idec 公司开发了用于治疗乙型血友病的Ⅸ因子 -Fc 融合蛋白和用于治疗甲型血友病的Ⅷ因子 -Fc 融合蛋白，其Ⅲ期临床研究结果显示，Fc 融合重组蛋白的血浆半衰期均比原型分子长，且对血友病患者急性出血有良好的预防作用。

2013年6月，美国糖尿病协会（ADA）芝加哥会议上，礼来公司公布了其开发的治疗 2 型糖尿病的新药dulaglutide 的Ⅲ期临床研究数据。该药由 GLP-1 类似物和 hIgG4-Fc 融合而成，是一种长效 GLP-1 受体激动剂，具有每周给药 1 次和耐受性良好的优点。3 项分别名为AWARD-1、AWARD-3、AWARD-5 的研究数据显示，与二甲双胍、艾塞那肽注射液（商品名：Byetta）和磷酸西格列汀（商品名：Januvia）相比，dulaglutide 有良好的降低血糖和控制体质量的效果。礼来已于 2013年10月向FDA 和 EMA 提交了新药上市许可申请，若能获得批准， dulaglutide 将与同样是每周注射1次的糖尿病药物——艾塞那肽缓释注射用混悬剂（商品名：Bydureon），以及每天1次的 Victoza、2 天 1 次的 Byetta 等药物角逐抗糖尿病药物市场。不少糖尿病患者往往需要 2 种或以上药物才能有效控制血糖，因此，只需要每周给药 1 次的注射剂具有很大的应用潜力。同时，礼来也在研发便捷且病人用药依从性较好的相关给药设备。

4 Fc 融合蛋白在疫苗领域的应用

疫苗设计的关键在于有效活化抗原递呈细胞（antigen presenting cell，APC），促进抗原递呈和激活免疫反应树突状细胞（dendritic cells，DC）是目前发现的功能最强大的抗原递呈细胞。采自病人的单核细胞可以先经体外诱导生成 DC，再通过抗原肽刺激、抗原基因转染、肿瘤提取物刺激以及与肿瘤细胞融合等方法负载相应的抗原，从而制备能够在体内诱导杀伤性 T 细胞，激发免疫反应的DC 疫苗，发挥长效的抗肿瘤、抗病毒作用。由于 APC 表面能够表达 FcR，所以抗原 -Fc 融合蛋白能够作为抗原运载工具，借助 Fc 片段靶向结合 APC，缩短抗原在血浆中的游离时间，减少蛋白酶对抗原的降解，提高抗原半衰期，从而加强抗原的递呈。其中，转染抗原 -Fc 基因的DC 细胞，不仅能够持续表达抗原 -Fc 融合分子，产生较长效的免疫激活，还可以克服其他体外抗原刺激方法不可避免的问题，如抗原 MHC 复合物解离或细胞 MHC 分子降解。由于细胞内能够结合 Fc 并影响免疫反应的受体蛋白如 FcRL（Fc receptor-like）和 TRIM21 （tripartite motif-containing protein21）等不断被发现，Fc 融合蛋白类疫苗能结合的受体不仅仅局限于 APC 表面的 FcR，应用前景也将大大扩展。

4.1 Fc 骨架的选择

目前用于疫苗研究的 Fc 融合蛋白大多数都以 IgG-Fc为骨架，Loureiro 等利用昆虫细胞表达了血凝素 /hIgG-Fc 融合蛋白，并证明了其在动物体内的免疫原性，为流感疫苗的研究提供了一种候选方案。Du 等将 H5N1 血凝素和 hIgG-Fc 融合构建重组疫苗，并证实该分子能够诱发已免疫小鼠产生较强的免疫反应。以 HIV 为治疗目标的多数在研疫苗也是基于最常见的 IgG-Fc 骨架，如 p24-mIgG1/mIgG2a、p24-mIgG2a、gp41-hIgG1等。但是，在某些特殊情况下，利用其他类别的免疫球蛋白作为融合骨架，可能会取得更好的治疗效果。比如，IgA 是黏膜免疫中最为重要的抗体分子，能够通过形成免疫复合物，诱导强效的促炎反应保护黏膜免受病原体的伤害，因此研究黏膜免疫疫苗时，将抗原与 IgA-Fc 融合比与 IgG-Fc 更适合。FcRL4 主要在上皮和黏膜淋巴组织边缘区的记忆 B 细胞上表达，是目前唯一已知的 IgA 的抑制性受体。有研究表明，下调 HIV 感染病人体内记忆 B 细胞的 FcRL4 等抑制性受体，能够促进 B 细胞的增殖，并提高 HIV 特异性抗体分泌细胞、B 细胞相关趋化因子和细胞因子的水平。因此，可以设计基于 IgA-Fc 骨架的 Fc 融合蛋白，封闭FcRL4 的作用，从而提高机体对 HIV 或其他慢性病毒感染的反应力。

4.2 效价的提高

为了提高 Fc 融合蛋白结合 APC 上低亲和力受体的能力，Mekhaiel 等构建了一种结构稳定、效价提高的包含 12 个融合抗原的 Fc 融合蛋白六聚体，并通过原子力显微镜展示了其柱状空间结构。没有融合抗原时，六聚体能选择性结合 FcγR，且亲和力大大超过了单体形式。融合抗原后，为了降低抗原与 Fc 片段空间结构的相互影响，可以选择铰链区较长的 IgG3 作为高效价多聚 Fc 融合蛋白的骨架。

4.3 抗原的选择

为了保证 Fc 融合蛋白类疫苗的有效性，应融合能够被 APC 上的固有受体识别的抗原，比如病毒表面糖蛋白抗原或肿瘤相关抗原等。Hong 等为了将 HBsAg 与mIgG2a-Fc 融合，构建了 Lentivector HBS-Fc-lv 重组质粒，质粒转染 293 细胞后，HBsAg 上清表达量为对照组（即转染了 Lentivector HBS-lv 质粒的 293 细胞）的 10 倍；以Lentivector- HBS-Fc-lv 免疫正常小鼠，能诱发 HBsAg 特异性被动免疫反应；而免疫 HBsAg 转基因鼠（血清中存在低水平 HBsAg，为 HBV 慢性感染模型鼠）则能破坏其免疫耐受，增强 HBsAg 特异性免疫反应，更重要的是实现了特异性抗体的血清转换，从而为抗病毒药物，尤其是慢性 HBV 感染治疗提供了新思路。诱发抗瘤免疫反应的一个重要挑战是实现 DC 细胞对原始或修饰后肿瘤抗原的有效摄取和加工，从而激活免疫效应细胞和限制调节性 T细胞的活性。Gil 等以双唾液酸神经节苷脂 GD2 的模拟肽 47-LDA 为抗原分子，设计了 47-LDA-Fcγ2a-DC 疫苗，该疫苗能够激活和扩增肿瘤特异性 CD⁸⁺ 细胞，抑制原发性肿瘤生长，诱发比 47-LDA-DC 疫苗更高水平的免疫反应和保护作用，且抗癌效果与表达 47-LDA-Fcγ2a 融合蛋白的重组溶瘤痘苗病毒疫苗的效果相当。

5 Fc 融合蛋白的非临床应用

可溶性Fc融合蛋白不仅在免疫治疗领域有重要应用，且随着研究的深入，还可以应用于流式细胞、免疫组化、体外活性检测和蛋白微阵列检测等非临床领域。功能分子（如酶、抗原、受体、配体、细胞因子等）融合 Fc后不仅能提高稳定性，而且可以通过 Fc 与 proteinA/G 的结合作用，将 Fc 融合蛋白绑定在连有 proteinA/G 的固相载体上，构建蛋白微阵列或微球，从而捕获复杂组分（如血液、组织液、细胞裂解液、淋巴液等）中能与之特异性结合的待测蛋白，以探索蛋白之间的相互作用。Ramani等将细胞分泌蛋白 -Fc 融合分子与 proteinA 微球结合形成多价复合物，构建蛋白微阵列，筛选能与其相互作用的分子。

治疗性抗体及其类似物的相关研究表明，以体内蛋白（如受体或细胞因子等）为直接靶点的药物可以有多种设计思路，包括直接拮抗其作用的特异性抗体、Fab 片段和受体 -Fc 融合蛋白等。随着生物信息学、结构生物学、计算生物学等学科的发展，通过分析已有的配体 / 受体结构信息和相互作用模型等，可以设计能与相应受体（或配体）结合的配体（或受体）-Fc 融合蛋白，其一方面保留了功能蛋白的活性，另一方面具有抗体 Fc 片段的多种性质，并可通过调整 Fc 的活性和功能，满足实际应用需要。Fc融合蛋白作为抗体应用的一个衍生领域，凭借其独特的结构和活性特点，在临床和非临床领域都将有着广泛的应用前景。

参考文献

PROGRESSIN PHARMACEUTICAL SCIENCES