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和你一起学习，这里是大土豆的circRNA学习笔记。初涉肿瘤相关，若有不周，还请指出。感谢各位看官捧场！ 前期提要上一期我们介绍了一个新兴的肿瘤 circRNA数据库 MiOncoCirc，主要包含已报道的临床样本、癌症及对照数据集，共计868个。采用的识别算法流程为 STAR + CIRCexplorer，同时有兴趣的小伙伴可以了解一下 CODAC(Comprehensive Detection and Analysis of Chimeras) 小工具，可用于跨基因来源的circRNA注释。本期内容为我对CELL最新文献的一点读书笔记。 关键词前列腺癌 (Prostate cancer) 前列腺属于男性生殖系统，主要功能是制造与储存前列腺液。前列腺癌是全世界男性中最常被诊断出的非皮肤癌、第二常见癌症，也是男性与癌症相关的第五大死因。在美国，前列腺癌患者的五年存活率约为99％，但是肿瘤转移到了腺体外，则可能会带来更多的麻烦。因此肿瘤的检测以及控制转移是临床上意义重大的课题。 (上述部分信息来源于wiki，图片来源于百科) 以往的检测手段为指检法、前列腺特异抗原PSA检测以及切片检测，检测过程痛苦，且容易错过最佳治疗时期。随着基因组的研究深入，两篇发表在 Nature Genetics 和 Nature Communications 的研究通过GWAS手段分别获得84个和62个前列腺癌相关的SNP位点。而芯片和RNA-seq数据也包含了诸多相应的预后信息，但是circRNA数据还是空白。因此本文对144列前列腺肿瘤进行非poly-A富集RNA-seq分析，结合长期的临床随访记录，分析获得1233条唯一的融合基因以及76311个不同的circRNA，并通过鉴定得到了前列腺癌细胞增殖所必须的circRNA171个。 文章概要
样本采集来自于患者根治性前列腺切除术切片样本，并对未经治疗的手术标本进行病理学检测，随后通过链特性测序获得数据。测序平台与策略为 HiSeq 2000 PE100，分析流程如下图所示，数据库编号 GEO: GSE113124。
鉴定获得的转录物与 The Cancer Genome Atlas (TCGA) network上前列腺癌亚型关联，通过机器学习的方式将来自于5个患者亚型（P1-P5）的4584个转录本区分为和五个RNA亚型：包括3,905个蛋白质编码和680个非编码（353个antisense，286个lncRNA，12个snRNA和29个snoRNA）。 经统计学分析发现，P1样本较其他来说癌症驱动基因 ( driver genes )的缺失比例更高，包括NKX3-1 (78% versus 42%; p = 1.6 x10^-3, proportions test), TP53 (50% versus 19%; p = 8.0 x 10^-3, proportions test), and PTEN (60% versus 30%; p = 8.7 x 10^-4, proportions test）；P2中的样本具有最高比例的CHD1缺失，可能与SPOP及CHD1 突变的TCGA亚型相似(fig. 1F)；44% (15/34) 的P3样本特征为复发性亚端粒 (recurrent sub-telomeric) 扩增的基因组亚型，而P4和P5与a copy-number quiet genomic subtype相关(fig. S1I,J)。
在recurrent fusions中 (fig. 1D)，正如之前的报道，几乎所有样本（142/146）都观察到的 SLC45A3:ELK4 融合现象。并检查了21个融合基因间的关系，有意思的是，肿瘤起始相关的 TMPRSS2:ERG (T2E) fusion与其他组既没有显著的共存也不存在互斥的关系。随后作者探究了其与40个已报道的基因组驱动事件发现，T2E融合与TP53和PTEN突变相关，而T2E-negative肿瘤中富集SPOP 和CHD1 突变。这些关联证实先前的发现，SPOP 突变通过独立于T2E 融合和 PTEN 缺失的机制驱动前列腺肿瘤发生。 同时作者分析了融合基因在转移性病变上的变化，相对于原发性肿瘤 (localized tumors)，转移性肿瘤17个融合显著富集，6个富集显著减少，包括转移性病变中的12个复发，但在原发性肿瘤中未检测到 (fig. 1E).
作者根据阈值(≥2 back-splicing reads [BSRs])在CPC-GENE cohort 筛选获得76311个不同的circRNA，根据circRNA能够抵抗核酸外切酶的特性，对比四个不经RNase 处理的前列腺癌细胞系测序结果，挑选25036个高可信度的circRNA作为后续验证对象(能够在RNase处理肿瘤样本中检测到) (fig. 2A)。 为了鉴定前列腺特异的circRNA，首先作者与circBase中已知的注释进行了比较。有趣的是，在鉴定的11个细胞或者组织源中只有1个包含了所鉴定circRNA的67% (fig. 2B, C)。并计算了每一个样本中所分析得到的转录本，包含来源线性，线性和环状 (fig. 2D)，来源线性与肿瘤进程相关也佐证了这些circRNA具有特异性。随后作者通过检验侧翼circRNA的内含子序列长度 (Mann–Whitney U test; p < 2.2 x 10^-16; CLES [common language effect size; McGraw and Wong, 1992] = 0.76),以及GC含量 (Mann–Whitney U test; p < 2.2 x10^-16; CLES = 0.42)等特征，分析circRNA来源基因的可变剪切事件。结果显示，高丰度circRNAs倾向于具有高丰度的线性对应物，环状和线性的转录物之间的相关性通常较低 (3%, FDR <0.05; ) (fig. 2G)。值得注意的是，在以往的报道中，线性转录本的丰度高于circRNA，而在此研究中，127个circRNAs显示出比其线性对应物显著更高的丰度（FDR <0.05; fig. 2H) 为了评估circRNA是否具有特定的癌症亚型，作者对所有的144个肿瘤进行共聚分析。与线性RNA相比，circRNA并没有可区分的亚型。但是，最高表达丰度的circRNA相当于每个样本中circRNA总的表达丰度。因此作者引入CRI 指数(方法如下)，并将患者样本分为4组 (fig 3A; Q1–Q4)。 具有极端circRNA分布（Q1, Q4）的患者的预后明显差于具有稳定分布的患者（Q2, Q3; fig 3B），circRNA的HRs范围和变异（log 2 HR: 2.97-6.03）大于线性形式（-1.99-2.02）。而环状和线形之间HRs 的低相关性（fig 3E，ρ = 0.07，p = 1.50 x10^-19）表明了其潜在生物学机制不同。
首先作者根据反向剪切位点设计了shRNA 以及针对circRNAs外显子之外的线性转录本的shRNA (fig 4A)，在2000个前列腺癌细胞系中高丰度表达的序列中得到1507个circRNAs和1075个线性转录本的靶向文库 (fig 4B)。在四种前列腺癌细胞系中的文库转导和嘌呤霉素选择后，收集第0天 (T0)，第8天 (T8) 和第16天 (T16) 细胞首先使用 MaGeCK 鉴定缺失的线性转录物。对于所有的筛选阳性对照组对比显著高缺失 (Mann–Whitney U test; p = 1.7x10^-28, CLES = 0.86)，而阴性对照没有体现 (Mann–Whitney U test; p = 0.92; fig 4C)；其次缺失的现象与时间点高度相关，归一化的 shRNA丰富变化可见图 (fig 4D). 此外，对比 Achilles shRNA 和 CRISPR 筛选，我们的筛选中线性转录本缺失更显著(Mann–Whitney U test; p = 5.2x10^-11 and 1.4x10^-4; CLES = 0.325 and 0.330)，因此作者采用相同的方法识别缺失的circRNA。结果显示，171个circRNAs (11.3%）在至少一种细胞系中是必需的 (fig 4E)；91.8% 的必需circRNAs，其线性对应物并不是必需的 (fig 4F)，表明circRNAs驱动细胞增殖而不依赖于它们的线性对应物。 随后作者随机挑选10条上述至少出现在两个细胞系中的功能性必需circRNA，通过 sanger 测序以及 qRT-PCR 进行序列验证。然后使用两种shRNA进行敲低实验 (KD) 及过表达 (OE)，以 qRT-PCR 验证 KD 效率，并结合样本细胞的增殖速率验证circRNA的功能 (fig 4G)。为了确定circRNAs同种型的功能是否存在冗余，作者通过回复实验验证显示，5条circRNA部分功能回复，说明存在功能冗余情况。
由于 circCSNK1G3 的来源基因在四种前列腺癌细胞系以及任何的 Achilles 筛选中都不是必需的，而 circCSNK1G3 在四种前列腺癌细胞系以及两种其他肿瘤细胞系中为必需的特性 (fig 4G)，作者挑选其作为进一步验证对象。 circCSNK1G3 由三个外显子组成，总长度为536个碱基对（bp），并且以与其线性对应物相似的丰度存在 (circular:linear ratio: 0.79; fig 5A and 5B)。为了研究 circCSNK1G3 促进细胞增殖的机制，作者对 circCSNK1G3 的 KD 或 OE 后的 PC-3细胞进行 RNA-seq。基因集富集分析（GSEA）表明，许多基因在OE样品中上调而在KD样品下调，反之亦然 (fig 5C)，而 circSTAU2 和circGOLPH3也观察到类似的模式，表明在KD和OE实验中观察到的表型不是由脱靶效应引起的。而 circCSNK1G3 与 CSNK1G3 的富集分析结果显示，circCSNK1G3 独立于其线性对应物驱动前列腺癌细胞增殖 (fig 5E, F)。
通过预测以及AGO-紫外交联免疫沉淀结合测序 (AGO-CLIP-seq) 手段挑选与circCSNK1G3互作的miRNA，确定了10条候选miRNA。并结合 CPC-GENE cohort (n = 119) 的miRNA表达谱数据，分析miRNA与其circCSNK1G3之间的关系。五种miRNA，miR-181a / b / c / d和miR-196b，与circCSNK1G3表达显著相关 (fig 6A)，预测的结合位点位于外显子2的高度保守的AGO结合位点内 (fig 6B)。RNA pulldown实验中，生物素标记 circCSNK1G3 中观察到miR-181b / d的显著富集 (fig 6C)。随后通过生物素标记miR-181b / d反向验证circCSNK1G3 (fig 6D)。PC-3细胞中的miR-181b / d 过表达显著降低CBX7丰度，CBX7是一类miR-181b标靶、前列腺癌中的肿瘤抑制因子(fig 6E)。而circCSNK1G3敲低后miR-181b / d的下调一致，CBX7丰度显著增加 (fig 6F)，但它们在circCSNK1G3 KD细胞中下调。与细胞周期基因的上调一致，miR-181b / d的过表达增加PC-3细胞增殖 (fig 6G)。
小结首先值得一提是，样本数量及临床数据之丰富。其次，通过非poly-A富集的测序手段，结合与线性转录本的分析，证实前列腺癌中 circRNA能够独立的发挥稳定功能，暗示其具有独特的预后信息可用于临床。大量的 shRNA 筛选实验以及KO/OE 回复实验，用于确定候选功能性必需circRNA。circRNA的海绵功能，也通过测序手段及实验方法证实 circCSNK1G3 至少部分通过与miR181b / d的相互作用促进细胞增殖。为未来的相关研究提供了丰富的资源。 拓展阅读ASCO GU 2019
美国临床肿瘤学会2019年泌尿生殖系统癌症研讨会于2月14-16日在旧金山举办。会上公布了一系列最新的治疗方案及新型药物，其中包括前列腺癌的研究进展。
在此提供一个获取最新资讯的网站，ecancer.org。 比如前列腺癌一种新药的评估：
以及一类新的治疗方案的评估：
有兴趣的小伙伴可以点击原文，查看最新报道。 |
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