22C3是唯一的伴随诊断抗体，28-8，SP263的检测通用性如何定位？

    以PD-1/PD-L1通路为靶点的免疫检查点抑制剂治疗已经成为肿瘤领域标准治疗的一部分。目前，至少已有5种免疫检查点抑制剂获得一个或多个国家药物监管机构得批准，用于治疗多种类型肿瘤及不同适应症。几乎所有涉及免疫检查点抑制剂的临床试验均一致显示，使用这些药物时患者应答率和预后与肿瘤细胞PD-L1表达水平相关。然而，只有Pembrolizumab获得美国食品药品监督管理局和欧洲药品监督管理局的批准需要使用PD-L1 IHC检测作为伴随诊断来确定患者是否符合其治疗标准，获批的试剂盒为Dako22C3，在确定NSCLC患者是否适合接受nivolumab和atezolizumab时，PD-L1 IHC则作为一种辅助诊断。

不同的PD-L1诊断试剂盒和检测技术，可能会显示出截然不同的染色特征，对其在临床使用中的互换性造成障碍。来自Blueprint I期研究结果显示，22C3，28-8和SP263用于评估肿瘤细胞的PD-L1表达时其分析性能具有可比性，而SP142 PD-L1检测试剂盒与其他试剂盒的相比敏感度偏低。BlueprintII期研究进一步证实I期结果，同时显示73-10试剂盒的敏感度高于其他检测试剂盒（如图1所示）。基于Blueprint研究数据，同时考虑病理科平台局限性，探索真实世界几种抗体通用性十分必要。

图1.使用5种检测试剂盒进行肿瘤细胞PD-L1染色比对结果

 

1. 1.  22C3 vs 28-8

通过检测420例日本NSCLC手术标本PD-L1表达，对比分析两种抗体22C3和28-8检测结果一致性

材料及方法:

分析420例IA到IIIA 日本NSCLC手术标本，标本切成5um厚度，使用22C3和28-8进行染色，两个实验室分别独立评估染色结果，22C3由Merck/Dako培训后的一位病理医师评估，28-8则由BMS/Dako培训后的一位病理医师评估。通过整体一致性OPA（overall percent agreement），阳性一致性PPA（positive percent agreement），和阴性一致性NPA（negative percent agreement）三个指标评估22C3和28-8检测结果的一致性。

结果：

患者特征

患者入组情况如表1所示。中位年龄69岁，男性占比63%，有吸烟史占比69%。患者临床分期和病理分型情况如图2所示。

 

  

 

图2.临床分期和病理分型情况

结果分析

22C3或28-8染色结果为阳性（≥1%）的176例，占比41.9%，22C3和28-8染色均为阴性（＜1%）的244例，占比58.2%。PD-L1表达≥1%示例图如图3A所示。在176例阳性结果中，22C3组PD-L1表达高于28-8组（中位值【范围】，30%【0-90%】vs 10%【0-100%】），图3B给出了22C3组表达高于28-8组示例图。

图3.（A）分析176例 PD-L1 ≥ 1%阳性结果数据，分别使用Dako 22C3 和Dako 28-8 pharmDx进行检测。(B) Dako 22C3 pharmDx 和Dako 28-8 pharm Dx不一致结果代表图。Case#S8-50 (腺癌), Dako 22C3检测结果为 80% of PD-L1表达, 而Dako 28-8检测结果仅为10%。case#S6-7 (鳞癌), Dako 22C3 检测结果为90% of PD-L1表达, 而Dako28-8检测结果仅为50%.

根据1%，25%，50%三个cutoff值对22C3和28-8染色结果进行分层分析，详细数据如表2所示。PD-L1 TPS≥1%，22C3组和28-8组分别为154例（36.7%）和152例（36.2%），无显著性差异。然而，PD-L1≥25%，22C3组为96例（22.9%），28-8组为57例（13.6%），22C3组显著高于28-8组（P=0.0006）；PD-L1≥50%，22C3组为69例（16.4%），28-8组为39例（9.3%），同样是22C3组显著高于28-8组（P=0.003）。

不同cutoff值评估22C3与28-8的OPA和Cohen’s kappa详见表3A。1%，25%，50% cutoff值，22C3和28-8组的OPA分别为89.0%(95%CI, 86.1–92.0 %), 90.2% (95% CI, 87.4–93.1%) 和91.9%(95% CI, 89.3–94.5 %)，Cohen’s kappa分别为0.763 (95% CI, 0.6990.828), 0.677 (95% CI, 0.588-0.766) 和0.643 (95% CI, 0.534-0.751)。

PPA和NPA情况如表3B所示。若以28-8作为参照标准评估22C3检测结果，1%，25%，50% cutoff值对应的PPA分别为85.5% (95% CI, 78.9–90.7 %), 98.3%(95% CI, 90.6–100 %), 和94.9% (95% CI, 82.7–99.4 %), NPA分别为91.0% (95% CI, 87.0–94.2 %), 89.0% (95% CI,85.2–92.0 %), 和91.6% (95% CI, 88.4–94.2 %)。相反若以22C3作为参考标准，评估28-8检测结果，PPA数据则降低，1% cutoff值,84.4 (95% CI, 77.7 - 89.8%)，25% cutoff 值58.3% (95% CI, 47.8–68.3 %)，50% cutoff值53.6% (95% CI, 41.2–65.7 %), 然而NPA仍保持比较高，91.7% (95% CI, 87.8–94.7 %), 99.7% (95% CI, 98.3–100 %)，99.4% (95% CI, 98.0–99.9 %) 。

表3.（A）Dako 22C3与28-8的OPA和Cohen’s kappa数据统计结果。（B）以28-8作为参考标准，评估22C3的PPA和NPA。（C）以22C3为参考标准，评估28-8的PPA和NPA。

图4.根据临床和病理因素按照不同的cutoff值分层分析Dako 22C3和28-8检测结果。（A）根据样本分离/储存时间分析两种抗体检测数据，储存时间为2年的样本排除在外数据显示两组无显著差异。（BCD）两组抗体数据对比显示，25%和50%cutoff值，在男性、有吸烟史、腺癌患者中，22C3组分类率高于28-8组。（E）50%cutoff值，IIA期患者22C3组分类率高于28-8组。

如图4A所示，不同的样本分离/储存时间，两种抗体检测PD-L1表达并无显著差异；如图4B-D所示，22C3组在男性，吸烟组，腺癌中PD-L1分类率（classificationrate）显著高于28-8组，另外，临床分期数据显示，IIA期22C3组的分类率也高于28-8组。

讨论

不断积累数据证实即便是不同批次样本和不同病理医师评估，Dako 22C3和28-8检测结果具有较高的一致性，说明在专业的实验室，经培训的病理医师进行PD-L1检测和TPS结果判读其结果是可靠的，可重复的。本研究的主要目的是探究不同临床情况下22C3和28-8试剂盒检测之前的相同和不同之处。为了达到研究目的，尽可能的降低了肿瘤异质性和判读误差，使用最新的组织切片，同时两个实验室有CLIA资质的医师进行独立评估。420例日本NSCLC患者，22C3和28-8检测结果显示较高的OPA和PPA，无论是哪个cutoff值。尤其以28-8作为标准评价22C3检测结果。然而当以22C3作为参考标准评估28-8检测结果，PPA数据明显降低，25%和50%cutoff值PPA分别为58.3%和53.6%，但1% cutoff值PPA仍然较高，为84.4%。这些数据显示22C3评估为TPS 25%和50%的患者，经28-8检测分别只有58.5%和53.6%的比例为25%和50% TPS。

研究说明25%和50% PD-L1 cutoff值评估，22C3和28-8不一致性率更高。该研究结果与之前探究22C3和28-8一致性的一些研究结果一致，详见表4。Blueprint I研究中，以28-8作为参考，1% PD-L1 cutoff ，22C3 PPA为96.2%，反之则低。在Ratcliffe等研究中493标本经一名病理 医师评估，以28-8为参考标准，1% cutoff，22C3 PPA为92.5%，反之50% cutoff，28-8 PPA为97.5%。总之这些研究说明，22C3和28-8在某些条件下其结果存在不一致，尤其是在对比阳性结果时。本研究中，22C3检测组PD-L1表达，在25%和50% cutoff值，其结果高于28-8组，在男性，吸烟史和腺癌亚组中结果也偏高，不同的抗体对于PD-L1检测可能会有影响，进而影响医师对于结果判读。

总之，研究结果显示尽管整体一致性较高，25%和50% cutoff值，以22C3作为参考标准评估28-8检测结果，数据存在较高的不一致性，说明28-8阳性结果为22C3阳性，反过来则不然。以28-8替代22C3评估PD-L1表达可能会漏掉一部分阳性患者。

 

2.22C3 vs SP263

对比NSCLC SP263 和22C3PD-L1检测结果一致性

Dako 22C3 pharmDx是唯一获批的Pembrolizumab伴随诊断试剂盒，该试剂盒基于Dako Autostainer 仪器，相比之下Ventana BenchMark平台覆盖率更高。SP263是否可用于替代22C3来用于Pembrolizumab用药前优势人群的筛选呢？Fujimoto等研究发现，通过22C3和SP263抗体评估100例NSCLC PD-L1表达，其结果整体一致性为88-97%，不同cutoff值之间PD-L1 TPS 并无显著差异（P=0.455），说明SP263可以代替22C3作为指导PD-1免疫检查点抑制剂治疗。如果两种抗体使用同一平台Ventana，检测结果差异较小。在评估PD-L1阳性结果中，SP263和22C3差异相对较大，使用SP263代替22C3进行筛选可能漏掉部分适合Pembrolizumab治疗的患者。Sughayer等研究结果与此相似，通过评估51例NSCLC标本22C3和SP263结果，发现两组数据具有较高的相关性，Pearson相关系数为0.95，说明两组数据几乎完全一致（95% CI，0.92-0.97，P＜0.0001），这一发现说明SP263可以代替22C3用来评估NSCLC PD-L1表达，同时 因为SP263用于Ventana平台，可以更广泛应用用临床。SP263与22C3检测PD-L1表达结果一致性究竟如何，仍需更多研究予以探索和证明。

通过真实世界研究数据对比分析了28-8, SP263和22C3结果一致性，28-8和SP263均有可能漏掉一部分22C3检测为阳性的患者，对于筛选Pembrolizumab治疗人群仍存在一定局限性。考虑到平台局限性，22C3在Ventana Benchmark和 Dako Autostainer平台数据一致性探索，或可成为突破平台限制的一种方法。

 

  

参考文献

1.PD-L1 Immunohistochemistry Comparability Study inReal-Life Clinical Samples: Results of Blueprint Phase 2 Project. Tsao MS, KerrKM, Kockx M, Beasley MB, Borczuk AC, Botling J, Bubendorf L, Chirieac L, ChenG, Chou TY, Chung JH, Dacic S, Lantuejoul S, Mino-Kenudson M, Moreira AL,Nicholson AG, Noguchi M, Pelosi G, Poleri C, Russell PA, Sauter J, ThunnissenE, Wistuba I, Yu H, Wynes MW, Pintilie M, Yatabe Y, Hirsch FR. J Thorac Oncol.2018 Sep;13(9):1302-1311.

2. Comparison of 22C3 PharmDx and SP263 Assays toTest PD-L1 Expression in NSCLC. Sughayer MA, Alnaimy F, Alsughayer AM, QamhiaN. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2018 Jul 17.

3. Comparison of PD-L1 Assays in Non-small CellLung Cancer: 22C3 pharmDx and SP263. Fujimoto D, Yamashita D, Fukuoka J,Kitamura Y, Hosoya K, Kawachi H, Sato Y, Nagata K, Nakagawa A, Tachikawa R,Date N, Sakanoue I, Hamakawa H, Takahashi Y, Tomii K. Anticancer Res. 2018Dec;38(12):6891-6895.

4.Comparative study of programmed cell deathligand-1 immunohistochemistry assays using 22C3 and 28-8 antibodies fornon-small cell lung cancer: Analysis of 420 surgical specimens from Japanesepatients. Saito T, Tsuta K, Ishida M, Ryota H, Takeyasu Y, Fukumoto KJ, MatsuiH, Taniguchi Y, Yanagimoto H, Kurata T, Murakawa T. Lung Cancer. 2018 Nov;125:230-237.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

参考文献

1.PD-L1 Immunohistochemistry Comparability Study inReal-Life Clinical Samples: Results of Blueprint Phase 2 Project. Tsao MS, KerrKM, Kockx M, Beasley MB, Borczuk AC, Botling J, Bubendorf L, Chirieac L, ChenG, Chou TY, Chung JH, Dacic S, Lantuejoul S, Mino-Kenudson M, Moreira AL,Nicholson AG, Noguchi M, Pelosi G, Poleri C, Russell PA, Sauter J, ThunnissenE, Wistuba I, Yu H, Wynes MW, Pintilie M, Yatabe Y, Hirsch FR. J Thorac Oncol.2018 Sep;13(9):1302-1311.

2. Comparison of 22C3 PharmDx and SP263 Assays toTest PD-L1 Expression in NSCLC. Sughayer MA, Alnaimy F, Alsughayer AM, QamhiaN. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2018 Jul 17.

3. Comparison of PD-L1 Assays in Non-small CellLung Cancer: 22C3 pharmDx and SP263. Fujimoto D, Yamashita D, Fukuoka J,Kitamura Y, Hosoya K, Kawachi H, Sato Y, Nagata K, Nakagawa A, Tachikawa R,Date N, Sakanoue I, Hamakawa H, Takahashi Y, Tomii K. Anticancer Res. 2018Dec;38(12):6891-6895.

4.Comparative study of programmed cell deathligand-1 immunohistochemistry assays using 22C3 and 28-8 antibodies fornon-small cell lung cancer: Analysis of 420 surgical specimens from Japanesepatients. Saito T, Tsuta K, Ishida M, Ryota H, Takeyasu Y, Fukumoto KJ, MatsuiH, Taniguchi Y, Yanagimoto H, Kurata T, Murakawa T. Lung Cancer. 2018 Nov;125:230-237.