师姐心血之作 | 成功培养细胞的技巧都在这里了

本篇细胞培养技巧乃师姐真传，囊括细胞身份验证、细胞培养准备、细胞生长及细胞分析，将助您成为细胞培养高手。

细胞培养是生命科学研究的核心部分，培养技术也在不断发展。正确地优化工作流和使用最新的最佳实践是获得一致性结果和推进研究的关键。

细胞身份验证

据估计，多达一半的细胞系被鉴定错误。正确和定期的身份验证是避免这种陷阱的关键。

计划未来的细胞实验

• 仔细选择细胞系，确保它能准确地反映感兴趣的生物，能经得起计划的实验操作，并能够产生可重复的结果

• 从提供适当细胞身份和质量控制文件的可信来源获得细胞

• 不分享或非正式渠道购买细胞系，坚持身份验证和正式文档

开发新的细胞系

• 仔细选择细胞系，确保它能准确地反映感兴趣的生物，能经得起计划的实验操作，并能够产生可重复的结果

• 从提供适当细胞身份和质量控制文件的可信来源获得细胞

• 不分享或非正式渠道购买细胞系，坚持身份验证和正式文档

目前使用的细胞

检查国际细胞系认证委员会(ICLAC)注册登记的错误识别细胞系。

使用DNA基因分型而非表型分析方法验证细胞，至少每年一次，理想情况是6个月一次。利用可用数据库比较短串联重复序列(STRs)和单核苷酸多态性(SNPs)是两种进行种内比较最经济和可接受的遗传学方法。

培养准备

成功的细胞培养需要适当的无菌技术和其他最佳操作实践的使用。

最佳细胞培养实践

• 适当的培训是必不可少的。为所有培养技术生成标准的操作程序(SOP)，并确保实验室的每个人都知道如何正确执行。

• 从信誉良好的渠道购买高质量的试剂和供应物资，并清晰记录批号。

• 定期消毒、校准和维修所有设备，包括吸量管、培养罩、孵育箱、显微镜和高压锅。

• 完成验证前隔离检疫新细胞系，防止污染。

无菌过滤

• 膜的选择取决于样本特征、组成和体积。被过滤样本的溶质和溶解分子或粒子必须化学兼容过滤膜。

• 样品搅拌和调整单位过滤面积的流量可以提高产量和有助于防止颗粒在膜表面形成聚合物。

• 净化和粗滤最好使用0.45μm大小孔径来完成。

• 大多数培养基和缓冲液的快速过滤使用0.45μm孔径大小的PES膜。

• 灭菌含血清和其他蛋白的培养基使用0.22μm孔径大小的PES膜。

• 去除支原体使用0.10μm孔径大小的PES膜。

• 极低蛋白结合和灭菌含高价值生物分子的溶液使用0.2μm孔径大小的PVDF膜。

细胞生长

• 完整、明确的标记冻存瓶。

• 尽可能在最低的传代次数冻存样品。

• 每种细胞系使用合适的冷冻技术，尽管有些细胞（如干细胞）喜欢超速冷冻，但大部分都需要慢速冷却。

• 液体vs.汽相氮存储：液相存储温度更低，对储存问题的反应时间更长，但污染风险和储存瓶破裂/爆炸较高；气相氮是储存细胞的良好替代，污染风险低。

• 为防止损失，在多个位置储存重要的保存物，并在冻存后不久取出一管评估细胞活力。

细胞冻存

通过模拟细胞的自然环境来保持细胞的健康并非易事。警惕性是关键。

在培养罩下:

• 从来不要一次处理多个细胞系，细胞系间不分享一瓶培养基。

• 在使用当天准备和过滤培养基。

• 特别注意血清质量。如果可能的话，购买批量血清并测试每一批以确保其支持细胞生长。

• 为了应对基因型和表型不稳定性，定期鉴定细胞并经常替换冻存培养物。

检测微生物污染

• 定期筛查感染，特别是最常见的支原体感染，其不会产生明显的污染迹象。

• 不经常使用抗生素来控制污染，因为他们可以掩盖感染的迹象。在不含抗生素的培养基中，细菌、酵母和真菌感染的迹象包括浑浊以及颜色和pH值的变化。

细胞分析

监测和量化细胞健康和功能是获得有生物学意义数据的必要条件。

细胞计数

• 经常计数细胞以检查你的细胞培养物状况。

• 库尔特原理是最精确的细胞计数方法， 基于库尔特原理的细胞计数器生成的数据不仅提供精确的细胞计数,还显示平均细胞大小和群体分布信息。

• 使用库尔特细胞计数器的另一好处是可以获得细胞群体大小分布的直方图，显示样品的单分散程度。

• 确保计数的细胞时混合均匀的，否则会由于细胞密度的局部差异导致计数有误。

• 转移细胞样品可能引入错误，在细胞培养罩内使用手持式自动细胞计数器是避免可变性、获得培养物精确信息的最佳方式。

• 准备样品时检测仪器规格，确保细胞直径和起始稀释度与计数方法兼容。

品质成就未来，一致才能可靠

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