cut-off 值的设立与验证

生物_医药_科研 2019-03-21

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医学上的cut-off 值，为分界值、临界值或截断值的意思，是阳性判断值或者疾病的“阈值”，现已从非量值概念扩展到量值概念。cut-off 值的设立方式有多种，合理准确设立cut-off 值尤为重要。不同的检测程序cut-off 值不同，有时同一厂商不同批号的试剂cut-off值也会有差异，所以实验室应对厂商的cut-off 值进行验证，同时，笔者建议实验室尽量在较长一段时间内使用同一批号的试剂。在选择cut-off 值和报告检测结果时应该考虑敏感性、特异性或预测值哪个更重要。cut-off 是一个单词而不是短语不能写成cut off，目前仍有许多著作或期刊将cut-off 值写成了cutoff 值或cut off 值。

医学上的cut-off 值，为分界值、临界值或截断值的意思。起初它仅限于非量值概念，是用于判断酶联免疫吸附试验(ELISA) 定性检验结果的。近年来，又有部分定量的免疫检验项目如感染免疫、肿瘤免疫等引入了cut-off 值概念，它们所表述的cut-off 值是被检分析物的量值，多应用于那些正常状况下人体不含的一些检测成分，比如肿瘤标志物系列里的一些免疫检验项目，它们都会被厂商或实验室赋予某个值，超出此值就属异常，所以也就有人又称cut-off 值为“阈值”，cut-off 值设置的高，则阳性率低特异性高；相反cut -off 值设置的低，则阳性率高特异性低，例如：CAl9-9 用在诊断结肠癌病人时，如果其cut-off 值取37 Ｕ /mL，诊断阳性率为24%，如果其cut -off 值取25 Ｕ /mL，诊断阳性率为37%，如果其cut-off 值取15Ｕ /mL，诊断阳性率为49%，可见，如果cut-off 值设立的高，则阳性率低、特异性高、假阳性率低；相反如果cut-off 值设立的低，则阳性率高、特异性低、假阳性率高。针对ELISA 定性试验操作结果的判读，1997 年出版的《全国临床检验操作规程（第二版）》曾明确提出，目前无统一的方法，常用的有：（1 ）以P/ N ≥2. 1 ，即以待测血清吸光度复管均值/ 阴性对照吸光度均值≥ 2.1 为阳性；（2）以大于阴性对照吸光度平均值加影响因素0.05 为阳性；（3）以大于阴性对照的吸光度2 个标准差或3 个标准差、4 个标准差等为阳性。2006 年出版的《全国临床检验操作规程（第三版）》针对ELISA 定性试验操作结果的判定明确指出参比阴、阳性对照（或称阴、阳性质控品）的吸光度，以P/ N 比值或S/ CO 比值报告。P/N 比值：P 为待测样本吸光度- 空白对照吸光度，N为阴性对照吸光度- 空白对照吸光度，一般以P/N ≥ 2.1 为阳性；S/CO 比值：S 为待测样本吸光度，CO 为cut-off 值，常以阴性对照吸光度平均值×2.1 代表CO 值，一般以S/CO ≥ 1.0 为阳性，竞争法以S/CO<1.0 为阳性。

一般情况下，ELISA 定性试验cut-off 值的设立常用以下几种方式：（1）使用阴性血清测定结果均值的2 或3 倍作为阳性判断值：取一定数量（通常较少）的阴性血清样本，使用已建立的酶免疫测定方法或试剂盒测定，如果上述阴性血清样本的吸光度均值为0.05，则该次测定的阳性判断值为0.10 或0.15。例如当前实验室使用的试剂盒结果的判定多以P/N 或S/N ≥ 2.1 判定为阳性，其依据即是以阴性参考血清的2 倍作为阳性判定值。这种cut-off 值设定方法，可以较好地避免假阳性结果的出现，但假阴性可能比例较高。总的来说，这是一种非常粗糙的cut-off 值设定方法。（2）首先测定大量（数千）正常人血清样本，然后将所得到的吸光度均值加上2 或3 个SD 作为阳性判断值。当正常人血清样本数量足够大时，使用特定的酶免疫测定方法测得的吸光度值将呈正态分布，在具有95.3％ ( 单侧) 的可信度的情况下，可以将从正常人血清测得的吸光度均值+2SD 作为阳性判断值；如要求99.5％ ( 单侧) 的可信度，则以吸光度均值+3SD 作为阳性判断值。与第一种方法相比，这种cut-off 值设定方法更为科学一些，建立在统计学的精确计算的基础上，但由于这种方法仅考虑阴性人群其将整个“灰区”几乎都归为阴性，故而难以确定“灰区”，也有可能会出现较多的假阴性。（3）在测定大量正常人血清样本的同时，测定大量阳性血清样本，如测定值为正态分布，则根据u 检验的特点，以单侧99.5% 的可信限先分别确定阴性和阳性的cut-off 值；如为非正态分布，则百分位数法单侧95.3％或99.5％来确定cut-off 值。阴性和阳性人群的cut-off 值确定后，根据“灰区”的大小，综合平衡考虑假阳性和假阴性率的情况下确定cut-off 值。这种cut-off 值确定方法，较之单纯从阴性人群考虑相对全面一些，并且对测定的“灰区”有一个估计，不会出现将“灰区”全部纳入阴性的情况。（4）在测定大量正常人和大量阳性血清样本的同时，测定转化型血清（从阴性转变为阳性过程中的系列血清）样本，取假阳性和假阴性发生率最低，且能区别抗原转化至抗体出现点的吸光度值作为阳性判断值：该方法与上述“方法 3 ”的区别是增加了转化型血清样本的测定，使得阳性判断值的确定能最佳地将阳性与阴性样本区别开来。这种cut-off 值确定方法应该说是目前最佳的模式，但由于转化型血清样本非常昂贵且难以得到，因此应用起来有一定难度。（5）阳性对照吸光度值× 系数＋阴性对照吸光度值。目前大多数实验室还是采用第一种方法，虽然很粗糙，但是却很实际。在第二种和第三种方法中，试剂盒打开后随着时间的延长（在有效期内），阳性对照或cut-off 校正物的吸光度值都有下降的现象，这究竟是包被抗体含量下降、是酶结合物中酶的活性下降、还是阳性对照物或cut-off 校正物分解引起的，如果是cut-off 校正物分解引起的，我们仍以cut-off 校正物吸光度值作为cut-off 值，这会多了许多假阳性，如果以开盖时的cut-off 校正物平均吸光度值作为cut-off 值，若伴有酶及抗体的活性降低，那后期做的结果会有假阴性，一般一盒试剂用不了几天的，即使存放的时间长影响也不会太大，因为酶和显色剂都是足量过剩的不会因为效价稍降而影响显色效果。其实影响大的倒是每次洗板的情况与反应温度和时间，所以同一批试剂cut-off 值会有上下波动，同时我们发现所做的质控也呈锯齿状波动，没有什么规律。有部分实验室是以spss 软件来处理ROC 曲线数据，计算出某检验项目的cut-off 值。受试者工作特征曲线 (receiver operatingcharacteristic curve，简称ROC 曲线) 是根据一系列不同的二分类方式( 分界值或决定阈)，以真阳性率( 灵敏度) 为纵坐标，假阳性率(1-特异度)为横坐标绘制的曲线。传统的诊断试验评价方法有一个共同的特点，必须将试验结果分为两类，再进行统计分析。ROC 曲线的评价方法与传统的评价方法不同，无须此限制，而是根据实际情况，允许有中间状态，可以把试验结果划分为多个有序分类，如正常、大致正常、可疑、大致异常和异常五个等级再进行统计分析。为确保ELISA 定性试验检验结果判断的可靠性，cut-off 值的合理准确设立是非常重要的。

不同的检测程序cut-off 值不同，有时同一厂商不同批号的试剂cut-off 值也会有差异，所以实验室应对厂商的cut-off值进行验证，为此，笔者建议实验室尽量在较长一段时间内使用同一批号的试剂。验证方法：可选择健康人或其他疾病患者的新鲜血清120 份（也有建议选400~600 份的，可视具体检验项目决定），分3~5 批在3~5 天内检测是，计算这些数据的平均值和标准差SD，按照统计学正态分布特点，一般是按照+3SD 作为cut-off 验证值，这样理论上是覆盖了99% 的正常人群，此值应小于厂商标示的cut-off 值，否则选取+2SD 作为cut-off 验证值，这样理论上是覆盖了95%的正常人群（此值也必须小于厂商标示的cut-off 值，否则须重置）。cut-off 验证值有以下两种用途：（1）灰区的设定，其中血站一般只关心下限，而临床是上下限均关注的。（2）Levey-Jennings 质控图的控制限确定。灰区概念：把定量分析的正常值范围引入定性分析建立灰区概念，即将cut-off值的上下某段区域定为阳性可疑，需经复查或复检以确定其阴阳性，如仍落在灰区内则报告弱阳性。灰区范围设定通过cut-off 验证获得的值来界定，即灰区=cut-off 值±（cut-off值-cut-off 验证值），例如，实验室乙肝表面抗原ELISA 法cut-off 值为0.105，cut-off 验证值为0.062，则其灰区范围为0.062~0.148，吸光度在此范围内的标本需重测复查或用确认方法复检。试剂盒内的阴、阳性对照一般是用来计算cut-off值的，它们只能在同批号试剂内使用，检测位置应随机放置，它们不能作为质控指标，质控品必须是可以监控到不同试剂批号间变化的外对照，其数量应满足一个批号至少半年的实验量，分析方法或试剂盒的灵敏度和特异性等性能由cut-off值决定，因此质控品浓度应围绕cut-off 值选择，建议阳性质控品为cut-off 值的两倍左右，阴性质控品为cut-off 值的0.5倍左右。一般超高值的阳性质控品仅用来监控“HOOK 效应”只在引进分析方法或试剂盒时评价，长期监测是无价值的。在应用ELISA 法检测的过程中，往往临界值标本的作用比阳性标本更大，它不仅是室内质控的重要材料，而且还可以用来监测试剂质量的变化情况。一般试剂生产厂家在试剂盒中只提供了较强阳性标本，而未提供临界值标本。

大多数免疫分析项目，来自阳性和阴性人群的样本之间会有一个检测结果的重叠区，这就说明一个实验一般不可能有100% 的敏感性、特异性或预测值。在选择cut-off 值和报告检测结果时应该考虑敏感性、特异性或预测值哪个更重要。下面是 Galen 和 Gambino14 推荐的标准：（ 1）高敏感性：当疾病是严重的，并且是可治疗的，应该不能漏检；当假阳性结果不会导致严重的精神或经济创伤；和不合适治疗的后果不严重时，需要高敏感性。（2）高特异性：当疾病是严重的，但是不能治疗；当没有疾病时具有心理或公众健康价值；或如果假阳性结果可能引起严重的精神或经济上的创伤时（如，HIV 抗体的确证实验），需要高特异性。（3）高预测值：当不合适的治疗可能导致严重后果时，需要高预测值。（4）高符合率：当疾病是严重的，但是可以治疗，并且假阴性或假阳性结果同样严重时，需要高符合率。为确定以上因素的合适平衡点，应该用以下三种人群的样本评估分析的性能：疾病患者、没有疾病的健康人、其它疾病的患者。其它疾病的患者常不在评估之列，这样的人群用于似乎可以开展的分析，但是显示低的特异性、阳性预测值、符合率或所有这些。因不同年龄和不同人群的参考区间是不同的，所以需要确定不同年龄和不同人群的cut-off 值。试剂盒厂商一般已注明推荐的cut-off 值是怎么确定的以及在什么样的人群中确定的，比较理想的是，实验室确定自己人群的参考区间和cut-off 值，不过，若太偏离试剂盒厂商推荐的cut-off 值时应该谨慎。

要引起注意的是本文所述的cut-off 是一个单词而不是短语不能写成cut off，目前仍有许多著作、教材、期刊将cut-off 值写成了cutoff 值或cut off 值，这是一个极容易忽视的常见错误。牛津高级英汉双解词典8 版中对cut-off和cut off 各有详解：cut-off：截止点；界限。例：Is therea cut-off pont betweenchildhood and adulthood ？童年与成年之间有分界线吗？ cut off：停止，中断，打断，切掉，剪掉，阻挡，等等。They were cut off for notpaying their phone bill.他们未付电话费，被停机了。Out water supply has been cut off. 我们断水了。可见，cut off 才是分界点、截止点的意思，cut-off 值才是在医学上的临界值、分界值或阈值。