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首先需要明确一个概念，清洁验证是针对清洁方法的验证，这个概念一定不能搞错，不管谁问，一定要咬紧牙关说，这个就是针对清洁方法的效果确认，然后才有下一步。因此，我们在验证之前需要有一个清洁方法。当你撸起袖子，卷起裤管准备大干的时候，如果在验证之前，你就被告知，你只需要搞出一个验证出来，别的什么幺蛾子就不要折腾了，那么恭喜你，你要么努力说服领导，清洁验证不是那么的单纯，对生产也相当的重要，搞不好清洁不到位就会有不良反应增加甚至更严重的后果。当然了，这么大的世界，你也许会碰到油盐不进的，那么你有两个选择，要么把袖子裤管放下来卷起铺盖准备走人，要么背起锅开始在造假的路上起早贪黑，这过程的艰辛姑且不论，但是查出来的风险可不是你能承受得了的。在你衡量完这个之后继续我们的讨论。说到清洁方法，在你手头有现成的成熟的清洁方法的时候就不说了，可以跳过这一步，进行下一步的操作；如果没有成熟的清洁方法，那么恭喜你，你有机会从头开始了。当然了，清洁方法成熟的也不要高兴的太早，你还需要对现成的清洁方法进行评估。拿起你的清洁方法规程，对文件进行评估。这里评估包括很多方面，首先既然作为规程文件，他必须能够指导操作人员进行操作，这就是说不能有模糊的语句或者描述。打个比方：温度低于多少度（你拿什么测，要不要测，不测有什么影响）；配制适宜的某某溶剂（适宜是什么浓度）。操作规程能够让操作人员完全了解才是一个成熟可行的文件。之后需要对文件内容进行评估，比如明明这个产品都不能溶解在清洗剂中，还非要拿来操作。这样类似的问题有很多，可以参照下文中清洁方法的建立进行评估。 清洁方法的建立过程比较艰辛。首先你需要从各种标准、指南之类的文件中找到你所有共线生产的产品的物理化学性质，比如溶解性之类的信息，因为这个对你选择清洗剂真的很重要。了解好溶解性之后开始根据所有共线产品的溶解性进行分类。需要说明一下，清洗的过程可以认为是一个缓慢溶解或者稀释的过程，所以一定要可以溶解。如果你问我不能很好的溶解行不行？我肯定告诉你，行肯定行，你拿你的清洗剂一直冲吧，冲到地老天荒……根据分类选择到底需要一个清洁方法还是建立不同的清洁方法，这里的多个清洁方法也要分别进行验证。有了清洗剂，接下来就是清洁的过程。人工清洗相对更繁琐，因为需要描述和确定的东西比较说，比如怎么冲洗啊什么角度，水流速是多少之类的都需要进行描述，而且实际操作过程中，人工的随意性比较大，如果能在线清洗当然最好。针对在线清洗也需要进行不同的模拟和确认以最终确定方法。这里特别举例说一下喷淋球的确认，有些设备内部清洗主要靠喷淋球的作用才能达到理想的清洁效果，但是万一那个位置喷的不到位，那就尴尬了。喷淋球的确认可以先配置一定浓度的核黄素（维生素B2）溶液并均匀的涂布到设备的表面。干燥后用黑光灯检查荧光是否能覆盖所有的内表面，然后开启喷淋球按照预设程序运行，运行结束后待内表面干燥后再用黑光灯检查应无荧光。很多企业在使用在线清洗过程中容易忽略喷淋球的确认过程，使得后续会面对很多的质疑，这个确认最好弄成文字的东西以便查验。其他设施在安装过程中要避免盲管和造成湍流等因素，更不要造成管路死水的现象。 如果清洗方法都确认没问题，那可以准备计算限度和选择验证底物了。在这里需要注意，不是每个官方或者检察官都能认可拿最差的底物做挑战，如果你碰到这样的检察官，那么你可以忽略底物选择这一项，直接计算限度，然后针对每个品种（不是每个品规）进行验证，这个也是最麻烦和无奈的。当然大部分还是认可最差底物挑战这个思路的。这里最差的底物需要对产品进行溶解性的比较，即使都是易溶，也是分三六九等的。可以进行溶解度的实验并建立一个不同供应商、不同原料的溶解度档案，后续新增供应商或者新增品种可以在这个档案中进行增加补充。然后根据溶解度情况评出最难溶的原料作为模拟的底物，因为同样溶剂条件下，最难溶解的底物都可以清洗干净，那么别的品种也可以认为没有问题。接下来计算残留限度。单品种单独生产线的没有这个困扰，只要目视洁净就可以，如果多产品共线生产，则需要考虑上一品种在下一品种中的残留，因为这些残留可能产生副反应或者毒副作用。一般来说有三个比较常用的方法，基于最大日剂量的限度、基于最小批量的限度和基于毒性数据的限度。当然还要其他的计算方法，大家具体可以参阅一下文件结合自身情况和法规要求进行。 1、Guidance on aspects of cleaning validation in active pharmaceuticalingredient Plants（APIC关于药物活性中间体及相关产品的清洁验证指导原则） 2、Guideline on setting health based exposure limits for use in riskidentification in the manufacture of different medicinal products in sharedfacilities（EMA欧洲药品监管关于不同产品共线生产基于风险识别的限度设定指导原则） 3、Points to Consider for Cleaning Validation（FDATR29关于清洁验证需要考虑的要点） 4、Points to Consider for Biotechnology Cleaning Validation 2010 生物制品清洁验证考虑要点，2010 5、ICHQ3C 6、验证指南（2003） 大家可以根据自身水平和情况进行选择，其中第三条FDA的指导原则描述最详细，分类更完善，第五条ICHQ3C的描述说的是残留溶剂，但是有关于毒性系数的一般原则，最简单易懂的是验证指南，入门级别可以参考了解，但是因为太古董了，没有毒性考虑这一项（在新版验证附录里面要求了清洁验证要基于毒性）。其他的就不多说了。大家在计算时需要准备的数据有最小批量、当日产品最大用药剂量和最小剂量、共线设备的总面积和毒性数据。在这里，也对这些数据的来源和查找方法进行一下说明。最小批量的要求在工艺规程及其附属文件中可以查询到，但是有些企业定的比较坑，小到你感觉不到是机器生产的，这个问题真的很尴尬。当日最大用药剂量和最小剂量，产品说明书上都有，不用考虑不一致的情况，说明书都是监管部门批准并且大家都是统一的，根据任何状况下的用药剂量和用药次数算出最大最小剂量即可。共线设备面积，这个比较费劲，需要将所有共线设备的全部接触药品的表面积都加上，这里重点说一下是在可能的情况下多给一点预留面积，不一定什么地方你没有计算到或者增加个什么东西，那样你就麻烦大了。最后是毒性数据，这个有很多来源，可以查化学品手册或者毒性数据库，drugfuture是一个不错的选择。 所有数据都准备齐全之后可以根据之前选定的计算方法开始计算。这里注意，你可以列矩阵对每一个品种作为上一批对应每一个品种作为下一批进行计算，也可以根据最极限的情况计算（分子选同一项下最小值，分母选同一项下最大值），特别是在限度特别低的情况下建议用矩阵方法，虽然算起来费劲但是限度可能高一点。这里最后得到的是一个重量/面积的数值，拿到限度数据之后可以看一下限度的操作性，因为不一定你的限度可以用到实际情况中。如果限度太低可以通过以下几个思路进行调整，①减少共线设备的面积（这个很难做到）；②最低限度或者毒性最大的产品单独生产线生产（这个成本很高，你老板不一定会让你这样做）；③增加取样面积（要根据自身设备看看是否可行，有些部件的面积不一定够）；④减少取样过程溶剂用量（根据取样方法看最少可以是什么样）；⑤把最小批量调大（在前文中说了，这一条比较麻烦，有时候为了生产部操作方便不一定会让你修改）；⑥对取样后的样品进行浓缩（一定要看一下样品能不能这么早，如果样品不是安静的美男子，那就呵呵了）；⑦安排生产的时候不进行最低限度的安排，选择高限度的安排然后再转。如果所有方法都试了，要不行不通要不不让操作，那……你可以歪门邪道的瞎走，要不你走。 你是不是以为限度算完了就可以安排生产准备大干了？NO，在开始之前，我们需要找一个尺度对限度进行测量（当然这个尺度也是要验证的，这个在下文中讲）。如果你是单独产品，那就没什么好说的了，目视洁净（大概能到4mg的级别吧，这个需要做一个确认）就可以，也可以拿非专属的方法进行测定。比如TOC、电导率之类的，只要你清洗后你的清洗剂理化性质和之前一样，那就可以。如果限度太低或者多种产品共同生产就用专属性的方法多一点。这里也简单对专属方法和非专属方法进行一个解说。非专属方法用的比较多的是TOC，用来测定被测样品中的总的有机碳的量，检测限度不低，但是也要对检测的线性做一个确认。专属方法指的是各品种标准规定中含量的测定方法用的比较多的液相方法，这个就不多说了。 下面详细讲一下分析方法的验证。我用液相方法来举例，这个也可以用到其他检验方法中。一般来说我们做分析方法验证（也叫方法学验证）的时候需要对以下项目进行验证：专属性、检测限、定量限、线性和范围、准确度、精密度、溶液稳定性和取样回收率。熟悉QC的可能会问我在确认方法的时候已经做过了，是不是可以不做了？答案是，不…可…以！QC在根据法定标准建立检验操作规程的时候已经对方法做了确认，但是确认的限度或者说浓度高于日常检验的浓度，线性范围也没有囊括进去，但是比如检测限和定量限之类的可以共用以减少工作量。接下来对方法学验证的每个项目单独的描述： 1. 专属性：证明方法对样品专属，在这里，你的取样用具（棉签之类的）、清洁剂之类的不能对产品检查产生影响。所以在进行专属性检查时，先进行空白（溶剂之类的）检查，然后将取样用具的清洗液进行检查，最后检查样品，通过对三个条件检查结果的对比可以得出结果。如果专属性不合格，那么你只好修改取样用具或者检验方法了。 2.检测限：检测限是方法可以检查出样品的最低限度。一般来说，液相都是三倍噪音峰值对应的浓度作为检测限，也有一些其他的标准。基于此，检测限不是一成不变的，不同环境、不同仪器、不同操作人员都可能对检测限的结果产生影响。同时，检测限只是一个大概值，因为毕竟浓度太低，稀释过程误差太大。 3.定量限：定量限是方法可以定量样品的最低限度。一般以十倍噪音峰值对应的浓度作为定量限。跟检测限一样，这个结果也会有差异，所以如果你的限度在定量限附近，那么就先考虑将限度提高或者想别的方法咯。要不然误差都会搞死你。这也是为什么我操作的时候把检测限和定量限放在前面的原因。 4.线性和范围：这个项目是确定方法在某个浓度范围内，检测结果和浓度成线性关系。一般来说，线性要求都需要达到两个九（0.99）甚至更高，这个可以参照你参考的法规进行设定。这里的浓度范围要囊括你的限度的范围。一般操作以限度为中间浓度，可以从50%-150%或者75%-125%，浓度范围合理都可以，但是一定要考虑实验室条件（比如吸量管规格等），但是尽量不要考虑90%-110%这样窄的范围。如果限度太低接近定量限，那么你设置浓度的时候可能没有操作空间，这个时候可以较低浓度集中，也适当设置高浓度。一般需要进行五个不同浓度的测定。 5.准确度：确定方法是不是能够准确的测定样品的含量。操作过程中可以选择几个不同浓度的样品进行测定，一般选择三个浓度分别测定三次，并计算RSD。RSD的标准可以参考相关标准，国内的话在药典附录9101里面有详细描述（你觉得我会告诉你ICH—EP是没有具体标准的吗？），根据被测物的浓度选定RSD的可接受标准，一般浓度越低RSD越大，回收率越低，制定标准的时候一定要有理有据。需要说明一下回收率这个概念和字面意思一样，指的是测定的含量和实际含量的一个比值，回收率当然是越高越好，但是不要刻意的拔高，后续的检查和偏差不是你能承受的。 6.精密度：检验方法的精密程度。通过重复性和中间精密度来体现。重复性操作可以选择某个浓度连续测定，然后计算结果的RSD，也可以不同浓度重复测定。RSD的接受标准可以参照上文中准确度标准的参考文件查询。中间精密度可以以高、中、低浓度对照品加入量与供试品中待测成分的控制比例在1.2:1，1:1,0.8:1，主要考察随机变动因素，如不同时间、不同分析人员、不同仪器对精密度的影响。 7.样品稳定性：进行这个试验是考虑到生产安排、取样安排和检验安排对样品的影响。日常检查都是现溶现测，清洁验证这个真的不好操作，那么就需要对样品的稳定性进行研究。通过对可能温度下存放时间的考察，确定住了那么久的冷宫还是可以保持原来的性质。这个项目可以为将来的取样和检验灵活性加分。当然，样品稳定性越好越有利。如果你的样品放好久都没有变化，那就随便你了，如果放置后含量会降低，那么需要控制各个环节的时间，同时最后计算最终残留值的时候也需要考虑这方面的因素。 8.取样回收率：这个项目是验证你取样过程的误差。通过对所有材料（共线设备的所有材料，一个都不能少）进行模拟取样，确认取样过程和结果符合你的标准。通常来说是划定一定的区域，将一定浓度的样品均匀喷洒，干燥后进行取样测试，计算回收率。这个回收率也是越高越好，如果不够高至少RSD可以比较恒定。最终确定取样回收率的时候不能70%、80%、90%就定为80%，如果RSD不行证明这个方法还是有问题，那就先查明原因再继续。 上面这些都做完并形成报告了，那就可以着手安排生产和各种培训了。需要特别注意的是：如果是新设定的方法，那么你需要考虑很多最差条件，比如最大批次、最长生产时间、生产后清洗前最长放置时间以及清洗后使用前最长放置时间，这期间可以安排一些小清场的模拟，为将来正式生产做准备，也可以安排进行一些别的条件的模拟；如果方法成熟的再验证那就只要考虑连续三批就好了。需要特别说明一下，这里的连续三批在没有充分理由，必须连续完成相同的清洁工艺，不得中断。例如产品A 清洗验证实施过程中不可以穿插生产和清洗产品B。这个一定要特别注意，首次模拟也要考虑这个问题，中间不穿插清洗产品B。 最后，就是取样和检验工作，还有根据结果计算实际残留值。实际残留值需要根据结果和各环节的回收率反算比较合理。顺便说一下产品放行，在针对新清洁方法进行首次模拟时，可以先对设备放行进行下一次的生产，这样可以照正常方案进行模拟。到最后产品放行时根据结果和限度值确定产品是否可以放行。如果验证过程中没有进行别的产品的生产，那么这些产品在检验合格后都可以正常放行，如果穿插别的产品，需要对下一产品限度值进行评估后方可放行。清洁验证状态的维护需要对日常的生产进行不断的维护，过程就不多讲了，最后特别提醒一句，新产品、新设备、新方法，反正是各种新都需要进行风险评估，确定限度是否变化，是否需要进行重新验证。这个在操作前可以有一定的预判性，将在研发或者在办证的产品都先加进来计算限度，这样省去很多麻烦。 作者：黄老师 |
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