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摘 要：目的 基于网络药理学和生物信息学方法分析丹参酮ⅡA治疗冠心病（CHD）的分子生物学机制。方法 利用PharmMapper数据库筛选出丹参酮ⅡA的作用靶点，利用OMIM、GeneCards、CTD数据库筛选CHD疾病作用相关靶点。利用STRING数据库进行蛋白互作网络分析，利用Cytoscape构建蛋白相互作用网络，利用ClueGO插件进行GO分析和KEGG信号通路富集分析，利用Systemsdock数据库进行系统分子对接，利用iGEMDOCK软件进行分子对接来预测丹参酮ⅡA对CHD作用靶点的结合性。结果 筛选出丹参酮ⅡA的潜在靶点173个；与CHD相关的靶点42个；信号通路49条。结论 丹参酮ⅡA治疗CHD具有多靶点、多通路作用的特点；其可能作用机制是通过调控CHD发展过程中的血压调节、细胞代谢、血管新生、内分泌、活性氧代谢等过程对CHD进行干预。 根据《中国心血管病报告2017》，2015年中国城市和农村居民CHD死亡率继续2012年以来的上升趋势，农村地区CHD死亡率明显上升。城市CHD发病率高于农村，城市地区下降趋势明显，农村地区呈上升趋势[2]。 丹参酮IIA是丹参的主要药效成分之一，具有对血管、血流的双重调节作用，能够减少血管内膜的增生，提高组织血流灌注、改善肾脏的微循环[3]，但其作用分子作用机制尚不明确。网络药理学及生物信息学的建立，使得研究中药的潜在成分及其作用基因靶点具有了可用的研究策略[4-7]。本研究通过对丹参酮IIA中作用靶点和CHD相关的疾病靶点进行筛选汇总，得出丹参酮IIA作用于CHD的作用交联靶基因，并且进行生物信息学分析得到丹参酮IIA分子作用机制。 1 材料与方法 1.1 丹参酮IIA化学成分靶点预测 使用TCMSP数据库（http://lsp./）收集丹参酮IIA药效成分信息，保存为mol2格式文件。将TCMSP中筛选出的丹参酮IIA化学成分分子结构以mol2的格式上传PharmMapper数据库[8-10]基于反向药效团匹配法，选择药物的药效团模型，设置最终产生300个蛋白构象，得到与化合物相关的靶点名称、基因名称、Uniprot ID、匹配值（fit score）等结果。对化合物预测产生的相同靶点进行 1.2 丹参酮IIA化学成分靶点蛋白互作（PPI）网络的构建 为了说明靶点蛋白在系统上的作用，将“1.1”项所得的丹参酮IIA潜在靶点信息上传STRING 10.5在线软件（http://），限定研究物种为人类，获得PPI网络图。STRING数据库是一个储存已知的和预测的蛋白质相互作用的数据库，包含蛋白间直接的和间接的相互作用，并对每个蛋白相互作用信息进行评价赋分，分值越高，蛋白相互作用置信度越高[11]，从而得出蛋白互作信息。将从STRING数据库导出的文件中node1、node2和Combined score信息导入Cytoscape3.6.1软件进行可视化分析，并得到网络分析结果。进一步设置节点大小与颜色反映度（degree）值大小，边的粗细反映Combinedscore大小，最终获得PPI网络。 1.3 丹参酮IIA与CHD相关靶点的收集 www.omim.org/）、GeneCards（https://www.genecards. org/）数据库检索CHD相关靶点，筛选并删除重复靶点基因，与“1.2”项获得的靶点进行交集比对，最终获得丹参酮IIA治疗CHD的潜在作用靶点。 1.4 相关通路和注释分析 以Gene Symbol的格式导入David 6.8数据库（https://david./）中，分别勾选生物过程（biological process，BP）、分子功能（cellularcomponent，CC）、细胞成分（molecular function，MF）。利用Cytoscape3.6.1中Clue GO插件，进行KEGG通路分析。其中Clue GO插件关联KEGG、Wikipathways、Reactome数据库中的信号通路及代谢网络，综合预测丹参酮IIA与CHD关键调控通路。选择“KEGG-Pathway”得到相关数据，利用公式计算出富集因子（rich factor，目标基因集中属于该通路的基因数量/背景基因集中该通路所有基因的数量），并绘制气泡图。 1.5 网络靶点特性分析 运用Cytoscape 3.6.1软件中插件Network Analyzer计算网络的拓扑参数。网络中节点之间如存在调控作用关系则以边相连。本研究基于平均最短路径、介数中心性、中心接近度、聚类系数、度值等参数评估节点在全网络中的关键性。 1.6 成分-靶点分子对接 1.6.1 系统分子对接（Systemsdock）Systems Dock Web Site（http://systemsdock.unit./iddp/home/index）数据库，是一个基于网络药理学的预测和分析的Web服务器，它应用高精度对接模拟和分子路径图来综合表征配体选择性，并说明配体如何作用于复杂的分子网络。系统对接应用AutoDockVina进行对接模拟，预测蛋白质和配体结合的性能，调整X-Y-Z坐标和网格大小以细化绑定的位置[12]。对接结果的分数是实验解离/抑制常数值（PKD/PKI）的负对数，docking scores的值通常为0～10。登陆Systems Dock Web Site 数据库，将丹参酮IIA治疗CHD的潜在的42个作用靶点蛋白输入PDB ID，找活性位点，计算格点，调整X-Y-Z坐标来细化位置。输入丹参酮IIA的分子结构，成功后开始对接，整理对接结果中的docking scores并分析。 1.6.2 iGEMDOCK分子对接 iGEMDOCK是一个开源的分子对接软件，使用iGEMDOCK，由GEMDOCK生成的预测结果能够被分子可视化工具直接可视化，并且通过后分析工具进行分析。iGEMDOCK通过基于对接位点（即蛋白质-配体相互作用）和化合物性质（即原子组成）使用k-均值和分层聚类方法提供后分析工具，操作简单，可以直接导入配体分子进行对接，并且允许多个配体同时进行对接，一般用于活性筛选和快速对接。其结果以能量的高低去判断与化合物结合程度，一般化合物分子与受体结合的构象稳定时能量越低，发生的作用可能性越大。在PDB（https://www./）中搜索42个共有靶点蛋白并保存为PDB格式。配体丹参酮IIA以mol2格式上传，设置软件为默认参数：generic evolutionary method为200，generation为70，number of solution为2。 2 结果 2.1 丹参酮IIA的化学结构及其潜在靶点信息 根据PharmMapper数据库以及经过文献检索查找丹参酮IIA已报道的靶点最终得到丹参酮IIA的潜在靶点173个，其中包括MAPK1、TNF、MAPK3、CASP8、MAPK8等。丹参酮IIA的靶点相互作用见图1。关系网络中节点详细信息见表1（仅列靶点度值最高的前30个靶点）。
2.2 CHD相关靶点数据构建及比对分析 在CTD、OMIM、GeneCards数据库共筛选出94 403个基因，根据相关度每个数据库取前300个靶点组建CHD相关靶点数据库。对丹参酮IIA靶点与CHD相关发病机制靶点进行核查比对，得出丹参酮IIA中与CHD相关发病机制的42个作用靶点基因，包括JUN、TP53、MYC、FOS、F2、CASP3等。丹参酮IIA成分靶点与CHD相关发病机制靶点韦恩图，见图2。丹参酮IIA对CHD作用靶点的PPI网络关系，见图3。丹参酮IIA对CHD作用靶点的蛋白互作网络的拓扑学分析，见表2。经NetworkAnalyzer分析网络拓扑学属性发现，该PPI网络中聚类系数为0.457，平均节点度为7.82，平均最短路径在2.33～6.38，介数中心性在0～0.22网络中节点的度值曲线、介数中心性曲线接近于幂律分布，其中42个重叠靶点是该方与疾病作用的关键分子基础，并在关系网络中体现了较好的连通特性。 经David数据库GO分析得出51个BP，包括药物反应、脂多糖的反应、凋亡过程的负调控等；11个CC，包括质膜外侧面、局灶性粘连、皱褶膜；7个MF，包括电子载流子活性、转录因子活性与序列特异性DNA结合、金属内切肽酶活性等，经Bonferroni校正P值均＜0.05，见表3。进一步被分为活性氧代谢产物、对氧含量的反应、平滑肌增殖的调节规律、对肌肉的反应、上皮细胞迁移的正向调节等，见图4。经ClueGO插件分析，共分析出49条信号转导通路，结果得到与心血管疾病相关度最高的9条相关通路，其中包括肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、Wnt信号通路、cAMP信号通路、PI3K-Akt信号通路、缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、核转录因子-κB（NF-κB）信号通路、Toll样受体信号通路、FoxO信号通路，将得出的49条信号转导通路进一步再聚类分为2组，分别为流体剪切应力与动脉粥样硬化、甾体激素生物合成，见图5。 2.4 丹参酮IIA成分-CHD作用靶点分子对接结果分析 之间有一定的结合活性，大于5.0表明对接分子与靶点之间有较好的结合活性，大于7.0则说明具有强烈的结合活性[13]。分子对接结果显示丹参酮IIA与MMP9、DPP4、SOD2、ITGB3、RAC1、NFKBIA、VCAM1、ECE1、CYP3A4、GCK、MDM2等35个靶点的系统对接得分值均大于5.0，由此表明丹参酮IIA与预测的CHD作用靶点有较好的结合活性。 2.4.2 iGEMDOCK分子对接结果 将CHD的42个潜在靶点与丹参酮IIA进行分子对接，由于ITGA2B、FOS的PDB结构没有原配体，因此无法进行深入分析。配体与受体结合的构象稳定时能量越低，发生的作用可能性越大。其中结合性最强的是CYP1A1，见图6。
3 讨论 CHD是冠状动脉血管发生冠状动脉粥样硬化病变或器质性狭窄、阻塞，从而导致心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病。CHD是高龄人群中最常见的心血管疾病，是导致中老年患者死亡的首要疾病，且其发生率和死亡率呈逐年上升趋势[14]。目前西医治疗对CHD以二级预防和冠脉血运重建术为主，且长期化学药治疗存在着耐受性差、耐药性强、不良反应重以及手术治疗经济负担重、手术禁忌证多、术后复发率高等问题[15]。而经研究发现[16]，中医药可以有效治疗CHD心绞痛，改善预后，降低病死率。在扩张冠脉、开放侧支循环、改善流变学及心功能，保护心肌细胞、调节血脂、稳定斑块及保护血管内皮等方面具有明显的效果，有着广阔的应用前景。丹参酮IIA为丹参酮中主要有效成分之一，通过抑制钙调神经磷酸酶活性和钙调神经磷酸酶mRNA表达等途径抑制血管平滑肌细胞增殖，起到扩张冠状动脉、增加冠脉血流量的作用并且可以保护缺血心肌，防止钙超载，减轻再灌注损伤[17]。现代药理学研究表明，丹参酮IIA可能通过抑制IMA、Bax蛋白升高及H-FBAP、Bcl-2蛋白降低对缺血再灌注损伤心肌组织和心律失常具有保护作用。临床上被证实联合其他药物可以明显改善患者的血脂、心功能及血流动力学，且安全可靠，未见明显不良反应[18]。 本研究通过筛选和文献挖掘寻找出丹参酮IIA 173个可能的靶点。在对丹参酮IIA GO分析的过程中发现血压调节相关的靶点包括SDHA、CYP3A4、VCAM1、GSR、CYP1A1、HSD11B1、CYP1A2、SOD2。其中CYP1A1是芳烃受体（AHR）激活后产生的一种外源代谢酶，但许多研究表明CYP1A1可以代谢内源多不饱和脂肪酸。Agbor等[19]在实验中发现，CYP1A1有助于n-3PUFA依赖性主动脉eNOS激活、NO依赖性、Ach介导的肠系膜阻力小动脉扩张和NO-血压的依赖性调节，由生理性AHR信号（CYP1A1的主要转录调节因子）转导产生的CYPlA1组成水平具有血管保护作用的功能。Guessous等[20]在研究中发现，3个CYP1A2变异的等位基因（rs762551、rs1133323和rs1378942）可以至少部分地驱动15q24.1位点来调节血压和高血压之间的关系。与活性氧代谢过程的正调控相关的靶点有CDKN1A、AGT、F2、TP53；与心脏发育相关的靶点有EDNRA、ECE1、EDN1、SOD2；与肌牵张反应相关的靶点有EDNRA、ECE1、EDN1、SOD2。进一步被分为活性氧代谢产物、对氧含量的反应、平滑肌增殖的调节规律、对肌肉的反应、上皮细胞迁移的正向调节等。均与心肌细胞代谢、心电活动、血流灌注等显著相关，该靶点及其机制均有大量实验研究论证支撑。进一步提示丹参酮IIA注射液治疗CHD可能与血压调节、细胞代谢、血管新生、内分泌、活性氧代谢等相关生物学过程有关。在丹参酮IIA对心血管疾病相关度最高的9条相关通路中，PI3K/Akt信号通路是重要的细胞凋亡通路，Akt可以抑制凋亡因子，进而抑制细胞凋亡，PI3K/Akt具有多种生物学作用，除上述血管重塑和细胞自噬的生理功能外，还可以调节代谢，进而影响CHD的发生和发展[21]。α（HIF-1α）的心肌保护效应与诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）增加可以减轻缺血再灌注损伤，改善心功能，在急性心肌缺血再灌注损伤兔模型上，PHD抑制剂预处理可增加血红素加氧酶，减少梗死面积，提示血红素加氧酶作（HIF-1）依赖性诱导血管生成因子促进心脏血管生长，抑制了HIF-1的活性，可以损害心脏血管生成和收缩功能，从而抑制血管生成阻止心脏肥大和诱导收缩功能障碍的发生。周茜等[24]通过实验发现促进MAPK的ERK的活化和减少促凋亡通路JNK和p38通路的激活，起到减轻心肌纤维化的药效，具有明显的心肌靶器官保护作用。罗永苗等[25]通过研究发现NF-κB是免疫炎症的重要转录因子，多种细胞因子和炎症介质可激活NF-κB形成正反馈，结果导致最初的炎症信号进一步放大，促使动脉粥样硬化的发生。抑制NF-κB活性，将会终止炎症介质的转录，最终限制免疫炎症反应，减少动脉粥样硬化的发生，延缓动脉粥样硬化的发展。吕宏娟等[26]在实验中发现，抑制Toll样受体可以减轻血管紧张素II所致心脏纤维化，Toll样受体参与血管紧张素II所致的高血压小鼠心肌纤维化过程。 系统分子对接和iGEMDOCK分子对接结果均显示，丹参酮IIA与丹参酮IIA对CHD作用靶点分子具有良好的结合活性，其中iGEMDOCK分子对接结果显示CYP1A1与丹参酮IIA有良好的结合性。说明丹参酮IIA可以与受体蛋白稳定结合并发挥作用。通过分子对接结果显示CYP1A1、CYP3A4、CYP3A2在对接结果中均显示良好的结合作用。研究表明[27]，部分CYP同工酶参与了丹参酮IIA的代谢，且丹参酮IIA在体外能强烈抑制CYP1A2的活性。丹参酮IIA能与AHR结合，而AHR作为一种配基激活转录因子，继而上调CYP1A2的表达能显著诱导CYP酶的活性以及基因、蛋白表达。分子对接的结果也进一步为丹参酮IIA治疗心肌梗死、心肌纤维化等心脏疾病提供了新的思路。
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