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荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization, FISH）通过荧光标记的核酸探针（~20nt-500nt）在组织细胞内原位标记相应的RNA分子。一种荧光基团标记的一个探针对应一个基因RNA分子的一段序列。超分辨率显微镜技术的发展，使我们能看见细胞内单个RNA分子。单分子荧光原位杂交（single molecule FISH，smFISH）能分析单个基因的RNA分子拷贝数和原位分布情况。受荧光基团和图像采集通道的限制，smFISH只能同时看到4到5个基因的RNA分子分布情况。科学家希望能同时分析多个基因乃至整个转录组水平RNA分子的时空分布情况，其中关键是结合超分辨率显微镜技术开发多路组合标记和多重读取系统（multiplexing）以实现同时对多个基因的识别。 2019年3月26日，Nature在线发表了加州理工蔡龙（谢晓亮教授在哈佛培养的博士）实验室的最新研究成果：Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH+。本文中，通过seqFISH技术进行四轮的RNA分子条形码标记（barcoding）实验，每轮实验中通过其独特60个假单色（pseudocolor）通道进行20次反复杂交和超分辨成像读取。这样，在普通共聚焦显微镜上实现了对10,000基因的mRNA分子在组织原位的观测和分析。 seqFISH技术通过多轮的荧光原位杂交实验和成像对单个RNA分子进行了条形码式标记和识别（图1）【1】。本文中每个基因设计有24个探针以识别，每个探针分子上有四段（I-IV）延展序列，以对应四轮的seqFISH标记实验。每个延展序列能通过与对应的读出探针（readout）杂交成像被读取。每轮对RNA分子进行条形码标记后，加入当轮的读出探针进行20次的反复杂交和成像读取（图1）。在三个荧光通道成像的情况下实现了在组织原位的对10,000基因的RNA分子的检测。 图1 seqFISH+技术：seqFISH的条形码标记和多重杂交成像读取。 本文中，对成像的细胞和神经组织进行了透明化处理【2】。本文能观察到不同RNA分子有相应的亚细胞定位，RNA分子呈现三个位置的聚集：核和近核区；胞质区以及突出区，反映了它们在功能上的不同。 图2 RNA分子亚细胞定位富集 本文还对小鼠脑部皮层，室管膜下层和嗅球区域进行了转录组水平分析，一共收集了2,963个细胞中RNA分子的分布。其中在皮层区域，检测读取到平均约 5,615 ± 3,307 (mean ± s.d.) RNA分子，分属于 3,338 ± 1,489 (mean ± s.d.) 基因。通过非监督聚类分析，发现不同神经细胞呈现分层排布，和以前的单细胞RNAseq成果相符合（图3）。 图3 不同皮层细胞呈现RNA分子组成的差异。 通过标记和读取设计系统的开发创新，本文在普通共聚焦显微镜下实现了对多基因（10,000）RNA分子在组织原位的定位和检测分析。单分子荧光超分辨率成像，组织透明化并膨大技术，RNA条形码标记，多重标记成像等多种技术并用，实现了对神经组织进行单细胞转录组水平的分析。 原文链接： https://www./articles/s41586-019-1049-y 制版人：半夏 参考文献 1. Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M. & Cai, L. Single-cell in situRNA profiling by sequential hybridization. Nat. Methods 11, 360–361 (2014). 2. Yang, B. et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue throughwhole-body clearing. Cell 158, 945–958 (2014).
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