质谱技术在抗体药物分析中的应用

摘要：质谱技术是抗体药物剖析最重要的技术伎两之一。本文简述了抗体药物的展开和质谱技术的原理。关于质谱技术在抗体药物的剖析中应用中止了归类整理，主要分为在一级构造和高级构造剖析中的应用。一级构造的剖析包括：准确分子量的测定、抗体药物偶联比、肽指纹图谱等，高级构造的剖析包括：氢/氘交流质谱、二硫键的剖析等。质谱法相关于其他剖析办法能够提供更为精确的数据，并能够得到多程度的剖析结果。
 

     关键词：抗体药物 质谱 一级构造 高级构造
      单克隆抗体药物的展开来源于1975年，Kohler 和Milstein 创建杂交瘤技术，为大量制备鼠源单克隆抗体提供了技术条件，创始了大范围制备单克隆抗体时期。抗体类药物是指含有抗体片段的蛋白类药物，能够和靶抗原特异性分别，并且愈加平安有效，所以在恶性肿瘤、本身免疫性疾病、心血管疾病、感染和器官移植排挤等严重疾病上得到了快速的展开，是当前生物药物范畴增长最快的一类药物。[1]
      1.抗体药物展开新趋向
       在生物药物范畴，抗体药物占领着越来越重要的位置，2015年全球销售排名前10 位的药物中有6 个为抗体药物，分别是humira、enbrel、remicade、rituxan、avastin和Herceptin。抗体药物按来源分类能够分为：鼠源单克隆抗体、人鼠嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。鼠源单克隆抗体是第一代的抗体药物，经过不时改造过渡到全人源单抗。目前，FDA 批准的单克隆抗体药物中，人源化单抗和全人源单抗数量已占领72%[2]
       1.1抗体药物偶联物（ADC）
       抗体药物偶联物（ADC）由单克隆抗体和小分子化合物两局部组成，小分子化合物通常是毒性很强的抗肿瘤小分子药物。经过抗体的靶向作用，ADC 的抗体局部和肿瘤细胞外表抗原特异性辨认并分别，经过细胞内吞作用，将抗体和小分子化合物一同带进肿瘤细胞内部，并在细胞内部发作水解反响，释放出小分子化合物，从而杀死肿瘤细胞。[3]这样既能够降低小分子药物的毒性，同时具有靶向分别的作用。曾经上市的两个ADC是Kadyla和Adcetris。
      1.2双特异性抗体（BsAb）
       双特异性抗体（BsAb）是含有两种特异性抗原分别位点的人工抗体，能在靶细胞和功用分子（细胞）之间架起桥梁，激起具有导向性的免疫反响，现已成为抗体工程范畴的热点。由于基因工程的展开，目前双特异性抗体曾经研发出多品种型[4]，主要类型有三功用双特异性抗体、IgG-scFv、三价双特异性分子、串联单链抗体(串联scFv) 、DVD-Ig 等多种方式。2014年第一个双特异性抗体Blinatumomab获FDA批准，靶向位点是CD19和CD3。
        2.质谱技术
        近年来质谱仪性能的显着改良主要基于开发出的两种离子化技术：一种是介质辅助的激光解吸/离子化(matrix-assisted laser desorption/ionization.MALDI) [5]技术。另一种是电喷雾离子化（Electrospray ionization，ESI）[6]技术。由于这两种电离技术的呈现，使本来只能检测小分支的质谱技术，能够运用于检测生物大分子。
       MALDI和ESI两种离子化办法都是软性离子化法，可以使生物大分子在离子化过程中的坚持完好性，剖析灵活度都极高，对低浓度的生物大分子样本也有很好的检测效果。目前，高效液相色谱电喷雾质谱仪联用（HPLC-ESI-MS）及飞行时间质谱仪(HPLC-ESI-TOF)联用已成为蛋白质组学实验中最常用的质谱技术。经过质谱技术能够得到肽指纹图谱，并经过与二维电泳的联用剖析蛋白质。往常这项技术越来越多的应用于抗体药物剖析中。与其它抗体办法相比，质谱剖析具有精确性高、灵活度高、剖析时间短和应用范围广的优势，但是由于质谱仪器高额的本钱限制了其展开。
       在过去质谱技术主要运用于对一级构造和序列的表征，而往常质谱技术越来越多地运用于高级构造的剖析，而高级构造关于抗体药物的生物活性至关重要。过去只需关于小分子药物，质谱能够中止定量剖析，关于大分子蛋白只可以中止定性剖析，而往常生物质谱不时展开，往常曾经能够中止半定量剖析，置信在不久的将来生物大分子的定量剖析也能够完成。
      3.质谱技术在抗体药物一级构造剖析中的应用
      3.1完好抗体药物准确分子量测定
      当得到抗体药物时，能够直接经过高分辨率的MALDI-TOF或者ESI-MS中止分子量的检测。经过关于脱糖后分子量的检测，能够关于抗体药物中止初步定性剖析，并将能够作为药物常规放行的剖析办法[7]。关于脱糖前的抗体药物中止剖析，能够得到抗体药物的糖基化类型的信息及糖基化程度的散布[8]，关于快速理解消费工艺与药物质量的关系具有非常重要的意义。该办法能够关于样品的分子量中止快速检测，适用于工艺过程样品的快速检定。
       3.2药物抗体偶联比（DAR）
        关于赖氨酸链接的抗体偶联药物，采用C4 色谱柱及联用的质谱对去糖基化样品中止剖析，依据偶联不同数目药物分子的质量数增加判别偶联数目[9]。关于半胱氨酸链接的抗体偶联药物，应用反相色谱( RP-HPLC) 串联质谱，测定药物抗体偶联比(DAR) [10]。关于质谱测定的结果，不只能够给出确切的药物抗体偶联比值，更可以给出链接不同个小分子药物的散布状况，及反响过程副产物空链接头的散布状况。[11]该办法能够得到更为精确的小分子散布信息，和UV-DAR办法相比更为精确。
          

                                            图1：抗体偶联物去卷积化前后图谱[9]
       3.3肽指纹图谱
       蛋白被特异酶切微店的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱。由于不同的抗体药物具有不同的氨基酸序列，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段也各不相同，肽混合物的质量数医具有指纹特征[12]。能够经过LC-ESI-MS中止肽片段的一级质量数的审定，也能够经过LC-ESI-MS/MS关于每个肽片段中止进一步确证，进步肽指纹图谱的精确性。关于抗体药物，能够关于应用质谱关于特征的氨基酸序列中止表征，定位在液相中的出峰时间，作为特征峰能够关于抗体药物中止有效的鉴别。该办法适用于终产品的放行审定，固然检测时间比拟长，但是关于样品的鉴别比拟全面而精确。
       3.4翻译后修饰研讨
       蛋白质的翻译后修饰（PTM）关于抗体药物的生物学功用非常重要。常见的翻译后修饰有：磷酸化、脱酰胺、甲硫氨酸氧化、糖基化修饰、N 端焦谷氨酸环化，C 端赖氨酸[13]切除等。普通特定的氨基酸的翻译后修饰，会给该氨基酸残基质量数的增加或者减少。如磷酸化会增加80Da；脱酰胺会减少1 Da等。因而，只用质谱剖析仪检测蛋白和肽片段的分子量倾向，能够完成高灵活、高通量和高准确地鉴别蛋白质的翻译后修饰的品种。[14]应用质谱同时能够对每个位点的修饰比例中止相对定量，从而能够比拟不同批次之间药物的差别性，也能够用于关于早期细胞菌株的选择。[15-17]相比拟于传统的HPLC检测办法，质谱法不只能够得出整体翻译后修饰的程度，也能够得到关于单个氨基酸程度的修饰程度。
       3.5测定抗体药物降解产物
       简直一切的蛋白降解产物和本来的蛋白都存在分子量的差别，质谱能够检测分子量的差别，从而检测这种降解产物。但是关于分子量超越20ku的大分子量的蛋白质. 质谱的分辨率不够，不可以检测微小的分子量的改动。因而通常是由肽谱图和质谱来共同肯定蛋白质的降解产物。将蛋白质酶解后的碎片用 ESI-MS 可找出与未降解蛋白质碎片的不同，来确证蛋白降解产物。[18]相比拟于HIC-HPLC，质谱法不只能够得出解说产物的比例，还能够得到解说产物的类型，关于剖析蛋白质的构造变化具有非常重要的意义。
       3.6 N端氨基酸序列检测
       常规N端氨基酸检测用Edman 降解法中止检测，但是抗体药物有时分会呈现N端环化的现象，在这种状况下用Edman 降解法需求先对平面中止去封锁处置，但去封锁的效率直接影响N 端测序结果，而直接运用质谱能够直接测出N端的氨基酸序列，同时能够检测出N端环化的相比照例。[19]
       4.质谱技术在抗体药物高级构造剖析中的应用
       4.1氢/氘交流质谱（HDX-MS）
       常规的质谱只能取得蛋白的一级构造信息，关于蛋白的高级构造无法中止深化的研讨。氢/氘交流质谱（HDX-MS）能够中止蛋白质构象，溶液动力学和表位映射中止剖析。在一个典型的实验中，将蛋白质复合物放在D2O中不同的时间，使H和D中止交流。然后在强酸性条件及低温下（0）将反响淬灭。将这种状态下的蛋白用特异性的蛋白酶中止酶切，将酶切的肽段经过nano UPLC-MS剖析，以评价各肽段的氘化程度。分别用离子淌度作为额外的分别伎两能够进步序列掩盖率。在可以调查的蛋白质的高阶构造和动态构造技术中，HDX-MS曾经证明适合单克隆抗体和单克隆抗体 - 抗原复合物的构象剖析。例如应用HDX-MS，一个完好的糖基化的IgG1相关于其去糖基化的蛋白的相比，显现出糖基化如何影响的IgG1构象。 [20-22]
       4.2离子淌度质谱法（IM-MS）。
       离子淌度是依据蛋白的电荷和外形选择性分别的办法，能够辨别相同分子量的蛋白和肽段，可用于检测蛋白的简单高级构造。IM-MS能够是一个适用的质谱表征的办法，由于它能够取得蛋白常规的高级构造，比方说蛋白是线性还是球形的，这在IM-MS中能够有很好的辨别。[23]
       4.3高分辨率傅立叶变换离子回鏇共振质谱（FTICR-MS）
        高分辨率傅立叶变换离子回鏇共振质谱（FTICR-MS）可以检测最高质量数的质谱仪器，并且有着很高的分辨率。FTICR-MS是目前被公以为是蛋白质组学研讨的有力工具，特别是和完好的蛋白质审定和上/下调翻译后修饰（PTM）蛋白质的审定。这预示着由FTICR-MS表征分子量很大的蛋白复合物，如完好的免疫球蛋白（IgA的二聚体或IgM五聚体），以及诸如抗体 - 抗原复合物的蛋白复合物。这是普通的质谱检测仪不具备的。[24]
       4.4电子转移解离（ETD）检测二硫键错配。
       二硫键的正确配对是维持蛋白高级构造的重要条件，当然蛋白质中也存在错误折叠的蛋白。经典的MS的办法依赖于比照恢复和非恢复样质量谱图，间接证明二硫键的存在。衔接有二硫键的肽段通常是比拟长的肽段，假定运用普通的裂解方式不可以得到较好的离子碎片。而在ETD的方式下，能够得到较好的离子碎片，中止二硫键的剖析。运用LC-MS办法加上线性离子阱ETD仪，以肯定蛋白的二硫键。[25-27]
       4.小结
        随着抗体药物的不时展开，需求关于抗体药物的构造信息不时中止深化的剖析，质谱技术也随着这一央求不时进步。在现阶段，由于生物质谱剖析的本钱很高，并且关于人员的央求比拟高，所以使其应用遭到了限制。除此之外，关于质谱剖析的样品必需坚持低盐的缓冲体系，而大局部蛋白样品必需在高盐的体系中才干比拟稳定，所以关于蛋白样品的前处置也非常复杂。当然随着技术的进步，能够预见质谱剖析会越来越多地运用于抗体剖析中，特别是在高级构造剖析的范畴，现阶段关于高级构造的剖析只需传统的生物学活性的办法，经过质谱剖析，能够让我们更多取得高级构造的信息，这关于抗体药物的剖析是极为重要的。此外，现阶段的质谱剖析只是半定量的结果，置信经过技术的展开，能够逐步转变为绝对定量的剖析。
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