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蛋白的特异性降解对蛋白稳态系统的维持至关重要，以及在细胞周期和压力响应等生物学过程中扮演着重要角色。在真核生物中，26S蛋白酶体是最主要的负责蛋白降解的蛋白复合物机器。通常底物被蛋白酶体降解会经历一下几个步骤：（一：binding）底物的泛素化修饰被蛋白酶体上的受体所识别，蛋白酶体的底部(base)含有多个泛素受体。（二：Insertion）底物蛋白的无序起始区域(unstructured initiation region)插入到蛋白酶体的孔道中。(三：Engagement)无序起始区域与孔道中ATPase的loops相互作用，在ATP水解的过程中产生机械力使底物被占有，这个过程会伴随着蛋白酶体构型的变化。（四：deubiquitination）蛋白酶体的盖子(Lip)部分的去泛素化酶Rpn11将底物的泛素切掉。（五：unfolding and degradation）底物去折叠为多肽后进入到孔道中进行降解。虽然关于蛋白酶体的结构生物学研究已经非常详细，但对于它在底物呈递过程中的每一个步骤的动力学和构象状态却很难被了解。 在这篇文章中，作者利用非天然氨基酸插入技术在体外重组的蛋白酶体的特定位点上引入荧光，并发展了多种版本的基于荧光共振能量转移(FRET)和各向异性(anisotropy)的检测方法用于研究蛋白酶体降解底物过程中每个步骤的动力学和构象变化。 作者挑选了一个模式底物是V15P突变的titin-I27结构域，其中包含了一个带有泛素链的赖氨酸和碳端无序的35个氨基酸尾巴。作者在titin折叠结构域上荧光，通过检查降解过程中该荧光的各向异性的变化，发现该底物整个降解过程的时间常数为18秒。分别在底物尾巴上和蛋白酶体孔道ATPase上引入荧光对，作者通过FRET技术检测到尾巴插入的时间常数是1.6s。分别在蛋白酶体的底部和盖子部分引入荧光对，作者通过FRET技术检测到蛋白酶体构型变化的时间常数为2.2秒。分别在底物尾巴和泛素上引入荧光对，作者通过FRET技术检测到底物泛素被切割的时间常数为6.8秒。基于以上结果，作者绘制出了蛋白酶体降解底物过程中的动态图谱，发现最费时的步骤是蛋白去折叠过程。 作者进一步评估了底物性质的变化对上述过程的影响。通过改变titin折叠结构域的稳定性，作者发现结构越不稳定的蛋白被降解的速率越快。通过改变泛素链的数目，作者发现多条泛素链并不会显著影响底物被降解的速率，作者认为可能是后续泛素链被切割的效率特别高。通过改变碳端尾巴氨基酸的个数，作者发现虽然尾巴短的底物虽然可以更快地插入到孔道中，但却不能有效地引起蛋白酶体结构变化，因此会被蛋白酶体所释放而不会被降解。 作者在具有低复杂度尾巴的底物上也发现了类似现象，表明这些性质会显著影响一个蛋白被降解的速率，并进一步影响它在细胞中的寿命。作者发现具有较差起始区域的底物机时在很高浓度下也很难竞争具有较好起始区域的底物的降解过程，这为理解细胞中不同底物被降解的优先级提供了理论基础。另外，作者意外发现具有较短尾巴的底物虽然不能被降解，但它的泛素链却可以很有效地被切割，从而暴露出更长的尾巴。作者猜测更长尾巴的氮端如果有另外一条泛素链将帮助该底物的降解，作者合成了相关的底物证实了该猜想，表明细胞中这些具有较差起始区域的底物可以通过更多的泛素修饰而提高被降解的优先级。 最后，作者提出了一个26S蛋白酶体工作的新模型。蛋白酶体拥有很快的底物识别和筛选过程，只有能够导致蛋白酶体发生构象变化的底物才能进入到被降解的处理过程中，而这个过程是相对比较耗时的。本文的研究无疑能够为理解蛋白降解和蛋白稳态调控提供重要的理论基础。 原文作者：QW |
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