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TP53INP1 deficiency maintains murine B lymphopoiesis in aged bonemarrow through redox-controlled IL-7R/STAT5 signaling 研究团队：Bochra Zidi, Christelle Vincent-Fabert, LaurentPouyet, Marion Seillier, Amelle Vandevelde,Prudence N’guessan, MathildePoplineau, Geoffrey Guittard, Stéphane J. C. Mancini, Estelle Duprez,,and AliceCarrier 期刊年卷：Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2019 0102;116(1) DOI：10.1073/pnas.1809980116 摘要： 所有来自造血干细胞（HSC）的血液和免疫细胞在骨髓（BM）产生。衰老过程中免疫细胞的减少是免疫衰老的特征之一。氧化还原失调对BM老化的影响仍知之甚少。在这里，该研究使用具有慢性氧化应激的tp53inp1缺陷（ko）小鼠来评估老化相关氧化还原改变对BM稳态的影响。我们发现，TP53INP1缺失对HSC的老化相关积累没有影响。相反，在tp53inp1 ko小鼠中，与衰老相关的淋巴室收缩得到缓解。在老年ko鼠BM中积累的B细胞是分化成功能性B细胞的细胞。重要的是，这种表型是由与氧化还原控制缺陷相关的B细胞引起的。最后，研究者发现，在衰老的tp53inp1缺陷小鼠中，氧化应激维持了早期B细胞中的stat5表达和活化，驱动了pax5高表达，为衰老后维持B细胞发育提供了分子机制。 背景： 骨髓（BM）是构成血液和免疫系统的所有细胞的来源，造血发育依赖于自我更新、增殖和分化过程的复杂调控。因此，骨髓包含许多不同的造血细胞类型，参与不同的分化途径。BM产生血细胞的过程贯穿于机体的整个生命周期。然而，随着年龄的增长，血型的稳态并没有得到适当的维持，从而促进免疫衰老、自身免疫性和血液恶性肿瘤的高发病率。这种功能下降与hsc功能的年龄依赖性恶化有关并由其促进，其特征是再生能力下降，并以牺牲淋巴祖细胞为代价向髓系祖细胞分化。在分子水平上，hsc功能的下降仍不清楚，但被认为是由细胞内在变化和BM微环境效应引起的。 年龄依赖性B淋巴细胞生成受损依赖于边缘缺陷抗体反应，增加感染易感性，降低老年人的疫苗接种反应。导致淋巴细胞丢失的细胞间隔尚不清楚，但研究已经确定了普通淋巴祖细胞或多系祖细胞水平的改变。衰老相关的变化也会影响B细胞的发育，特别是Pro-B细胞到Pre-B细胞的成熟。最后，老年BM中B细胞产生减少的分子机制包括转录因子的表达减少，主要在B系承担和分化中起作用。 造血细胞的产生可以大幅增加，特别是在压力情况下，如辐射或化疗诱导的BM消融或感染导致的血细胞减少，这种增加使BM和血液得到补充。在许多压力情况下，包括老化相关的压力，活性氧（ROS）的水平在BM内高度增加。这种过量的活性氧产生与hsc衰老密切相关。然而，在生理水平上，ROS在细胞内稳态、增殖和免疫功能方面起着第二信使的作用。在骨髓中，造血干细胞的稳态、分化和功能特性取决于细胞内的活性氧水平。 肿瘤抑制因子p53是调控hsc稳态的分子因子之一，部分通过参与氧化还原控制。该课题组已经证明肿瘤蛋白53诱导的核蛋白1（tp53inp1）是介导其抗氧化活性的主要p53靶基因之一。tp53inp1最初被鉴定为胸腺表达酸性蛋白，在淋巴器官中高度表达，随后被证明在炎症组织和应激细胞中过度表达。进一步研究表明，在氧化应激反应期间，tp53inp1通过激活发挥肿瘤抑制活性。此外，我们还发现tp53inp1参与了自噬过程，尤其是有丝分裂（线粒体特异性自噬），将生物能量代谢的tp53inp1调节与其肿瘤抑制活性联系起来。 编码tp53inp1（trp53inp1）的基因在小鼠淋巴器官（包括整个骨髓）中高度表达。在所有BM细胞群中表达，与干细胞相比，在定向细胞中表达更高。由于BM功能高度依赖于TP53inp1在其中发挥作用的应激信号传导，因此研究者利用患有慢性氧化应激的TP53inp1缺陷小鼠解决了TP53inp1在造血发育中的功能问题。研究发现，TP53INP1的缺失有利于维持老年小鼠氧化还原驱动的B淋巴细胞生成。研究者通过强调IL-7R/STAT5/PAX5信号级联在该表型中的主要作用，进一步揭示了潜在的分子机制。 结果一 TP53INP1缺乏对衰老后造血组织的影响。 研究观察到KO小鼠的长期hsc（IT-hsc）频率较低但显著降低，特别是在表达高水平CD150的IT-hsc群体中(Fig.1A)。然而，这种减少对分化程度更高的造血干前体细胞（hspcs）或特定的谱系没有影响(Fig.1 B)。由于tp53inp1参与了氧化还原状态的控制，并且由于BM老化以氧化应激增加为特征，我们试图分析tp53inp1缺乏对造血老化的影响。首先，我们研究了TRP53INP1表达是否在老年BM和不同造血室中被改变。我们观察到在老年人的整个BM和老年人的未成熟（hspc）、CD11b+和B220+细胞中，Trp53inp1的mRNA水平增加(Fig.1 C)。在WT和KO鼠BM中都可以检测到老化后骨髓样细胞的相对增加频率（Fig.1 B，左图）。相比之下，在老年WT鼠BM中观察到的B细胞减少的频率在KO鼠BM中被显著抑制（Fig.1 B，右图）。老年TP53INp1-ko小鼠的血液中也观察到B细胞相对于骨髓细胞的维持（Fig.1 D）。综上所述，这些数据显示TP53INP1缺乏对老年BM中B淋巴细胞群的主要维持有有益的影响。 Fig 1. TP53INP1缺乏对造血组织的影响。对于BM免疫表型，我们使用3个月大（称为“年轻”）和12个月大（称为“老年”）的性匹配小鼠。（A）幼年和老年wt和ko小鼠hspc室中的IT-hscs百分比。（B）年轻和老年WT和KO-BM中髓系（CD11b+）和淋巴系（B220+）细胞的百分比。在A到C中，年轻WT和KO小鼠n=5；老年WT和老年KO小鼠n=8和n=9。（C）在整个BM（WBM）和hspc、cd11b+和b220+细胞中，通过定量RT-PCR分析trp53inp1的表达。与9个月龄（WBM）和16个月龄（分类细胞）相比，3个月龄的C57BL/6J小鼠的mRNA水平标准化为36B4表达（每组n=3）。结果表示为平均值±SEM。＊P＜0.05。（D）3个月龄（WT和KO;n=3）和12个月龄（WT和KO:n=8）小鼠血液中髓系（cd11b+）和B（b220+）细胞的百分比。在A、B和D中，数据表示为平均值±sem；*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。 结果二 TP53INP1参与体内减少B细胞分化。 为了进一步研究tp53inp1KO小鼠在老化过程中B细胞的维持情况，我们监测了不同B细胞群在年轻（3个月大）和老年（16个月大）KO中的比值，并与WT鼠BM进行比较。(Fig. 2 A 和 B) 总的来说，尽管老年的tp53inp1 KO和WT小鼠的BM中CD19+CD23−分化的B细胞与年轻小鼠相比显著减少，但在tp53inp1缺陷小鼠中减少的程度较轻，导致CD19+CD23−分化的B细胞的频率较高。(Fig. 2A) CD19+CD23+循环B细胞的频率在tp53inp1KO和WT小鼠之间是相似的。(Fig. 2A). 结果，与野生型小鼠相反，在ko小鼠老化过程中，分化B细胞比率维持在与年轻小鼠相似的水平(Fig. 2A)。 这一结果表明，在KO动物衰老过程中，成熟B细胞的更替率可以更有效地维持。 通过对B细胞分化不同阶段的分析，我们发现TP53INP1的缺失并不影响早期的pre- B阶段，而是使老龄BM中pro-B细胞的比值恢复到接近年轻小鼠的水平(Fig. 2B)。这种积累在B细胞分化的后期被观察到(Fig. 2B)。有趣的是，与WT细胞相比，衰老的KO pro-B细胞(不是B220+总群体)的增殖率更高(Fig. 2C)，凋亡率无明显差异(Fig. 2D)。这表明，在缺乏TP53INP1的情况下，B前体增殖的增加维持了老龄小鼠B室的维持。这进一步表明，衰老过程中的B细胞损伤与发育缺陷有关，而与凋亡增加无关。 考虑到在衰老过程中保持高水平的B细胞发育的潜在重要性，我们提出了一个问题，即在衰老的TP53INP1缺陷小鼠中产生的大量B细胞是否具有功能。为此，我们首先对不同年龄的小鼠(3-、8-和16-mo-龄小鼠，Fig.3 A-C)进行免疫功能检测。图3显示了(1)免疫WT小鼠衰老后抗体分泌浆细胞(PCs)的频率和数量减少，(2)与WT相比，接种8-和16-mo龄KO脾脏的PCs的比值和数量更高，说明接种老龄KO小鼠后，B细胞成熟为PCs的情况更好。与WT相比，接种了疫苗的老年KO小鼠的Ig产量更高(Fig. 3 B and C)。这些数据表明，在年龄较大的tp53inp1缺陷小鼠中产生的B细胞具有功能，甚至比WT对免疫反应更灵敏。此外，我们还发现，在没有细胞数量差异的情况下，体外分化的浆细胞与衰老的KO脾B细胞相比，分泌的IgM量更高(Fig.3D)，提示TP53INP1的缺失有利于B细胞产生抗体的内在功能能力。 Fig 2.老龄TP53INp1 KO小鼠B细胞分化的维持。(A-B)在3个月大（“年轻”）WT（n=6）和KO（n=6）小鼠和16个月大（“年老”）WT（n=5）和KO（n=6）小鼠的骨髓中分析B细胞群。(A)分化B细胞定义为B220+CD19+CD23−IgM−/+，循环B细胞定义为B220+CD19+CD23+IgM+。分化B细胞和循环B细胞之间的比率如右图所示。(C-D)流式细胞术监测了pro-b和总B220+细胞的增殖和凋亡率。数据以平均值±扫描电镜（每组n=3-6）表示，代表两个独立实验。*p<0.05，**p<0.01。 Fig.3 衰老TP53INP1 KO小鼠功能B细胞的维持。(A-C)幼龄(3-mo-old)、中年(8-mo-old)、老年(16-mo-old)小鼠免疫实验。（A）第一次抗原注射后第22天，用流式细胞术定量脾脏浆细胞百分比，计算绝对数量。每个点代表一个老鼠。（B）采用ELISA法测定8-mo龄免疫小鼠不同时间点血清IgM和IgG1水平。每个点表示一个老鼠。（C）免疫16-mo龄小鼠D22日血清IgM和IgG1水平。(D）体外分化试验。脾细胞治疗与LPS体外1μg /毫升、等离子体在不同时间点细胞被量化通过流式细胞术和IgM水平在D4是浮在表面的监控。 结果三 TP53INP1通过内在氧化还原控制抑制B细胞的发育。 考虑到TP53INP1参与了哺乳动物在衰老过程中增加的氧化应激反应，我们接下来讨论了TP53INP1的抗氧化活性是否会作为一种内在事件影响B细胞分化。首先，我们观察到所有老年BM B细胞亚群中Trp53inp1 mRNA水平均高于年轻组。接下来我们在n -乙酰半胱氨酸(NAC)补充抗氧化处理下进行BM移植实验(Fig. 4 A–D)。重组后，与骨髓细胞(CD11b+)相比，KO重组小鼠淋巴细胞(B220+)的比例高于WT(Fig. 4B)。对淋巴细胞和髓细胞的测量发现，发育有利于KO重组小鼠淋巴细胞的形成(Fig. 4C)。抗氧化剂NAC的处理消除了这种表型，恢复了在nacc处理的KO移植小鼠体内的BM，类似于从WT 移植小鼠中分离出的BM(处理或未处理)。值得注意的是，在没有TP53INP1的情况下，前体(pro-B细胞和pre-B细胞)和未成熟细胞数量都有类似的增加，但在NAC处理后减少(Fig. 4D),提示TP53INP1在独立的B细胞分化阶段具有抗氧化活性。综上所述，这些数据表明TP53INP1抗氧化活性参与了限制B细胞的发育。 Fig.4 TP53INP1以细胞自主的方式控制BM细胞衰老后的氧化还原状态。(A)BM移植实验的实验方案。将2-mo-old雄性WT或KO inp1供体小鼠(CD45.1)的总BM细胞移植到辐照2-mo-old雄性CD45.2受体小鼠体内。当提示时，从移植当天开始，将NAC添加到供体小鼠(成对)和受体小鼠的饮用水中。术后14周进行分析。在血液和骨髓中分析嵌合的百分比。(B)WT或KO BM细胞对髓系(CD11b+)和淋巴系(B220+)的贡献，无论是否经过NAC预处理。(C)小鼠骨髓细胞与淋巴细胞的比例。(D)WT或KO BM细胞对未成熟B细胞和pro-B+的贡献，无论是否经过NAC预处理前b细胞(分别为B220+CD23 - IgM+和B220+IgM -)。(E)荧光共聚焦显微镜下Nrf2蛋白亚细胞定位的免疫荧光分析。早期B细胞(Pro-B + Pre-B)中3-mo-old(称为“年轻小鼠”)和16- 23-mo-old(称为“老年小鼠”)小鼠的富集部分被抗nrf2和抗CD2(区分CD2 - Pro-B细胞和CD2+ Pre-B细胞)抗体和DAPI所损伤。图中显示了前b细胞(B220+CD19+IgM - IgD - CD2 -)。（F）核Nrf2的定量(活化Nrf2)。每个点表示一个细胞。 结果四 tp53inp1缺失的B细胞前体的氧化应激通过STAT5通路维持B的分化。 为了进一步了解老年tp53inp1缺失BM中B细胞持续发育的分子机制，我们研究了IL-7R/STAT5信号级联，它通过诱导B细胞前增殖、上调Pax5(主要B细胞转录因子)和Mcl1(抗凋亡基因)来控制B淋巴的生成。首先，我们比较了年轻、老年WT和KO小鼠的B细胞中Pax5的表达情况,与WT pro-B细胞在衰老过程中呈两倍下降相反，Pax5在衰老的KO pro-B细胞中表达维持在较高水平（Fig.5 A)。有趣的是，NAC治疗完全消除了衰老的KO和WT小鼠之间的差异，这表明在tp53inp1缺陷的B细胞前体中ROS积累和Pax5高表达之间存在直接联系(Fig.5 A)评估Mcl1 pro-B细胞中表达时,我们观察到稳定Mcl1老年鼠WT细胞表达与年轻鼠相比,虽然在老年鼠KO细胞有显著上调,这是对NAC治疗逆转。接下来，我们研究了IL-7在体外刺激早期B细胞(包括pro-B和pre-B)中富集的CD19+IgM−IgD−组分中磷酸化STAT5(phospho-STAT5)的水平。il -7依赖信号在b细胞前期被关闭。我们观察到，与年轻的WT小鼠相比，老年小鼠在IL-7刺激下STAT5的磷酸化更少，相反，TP53INP1的缺失完全消除了年龄相关的STAT5磷酸化的减少，因为我们发现KO早期B细胞中IL-7刺激后磷酸化STAT5阳性细胞的比例高于WT细胞，且与年龄无关（Fig.5 B)同样，NAC处理完全逆转了高STAT5，即在没有TP53INP1的情况下磷酸化，这表明氧化应激在STAT5激活中起主要作用。(Fig. 5C)，排除了STAT5的高活化可能与KO早期B细胞表面IL-7R水平升高有关的可能性。Western blot实验证实，早期KO细胞中磷酸化stat5水平较高(Fig. 5D)因此，与老年WT相比，老年KO早期B细胞Stat5a mRNA水平明显升高,这种差异在nacl处理的小鼠中部分消除(Fig.5E)。总之，这些结果证明了氧化应激、活性STAT5的产生和老年小鼠早期B细胞发育之间的联系。 Fig.5 tp53inp1缺失的B细胞前体的氧化应激通过STAT5通路维持B的分化。使用三个月大(“年轻”)和16- 23个月大(“老年”)的老鼠。用流式细胞仪(FACS)对proB细胞进行分类（A)或早期B细胞磁分选(CD19+IgM- IgD -)(B、D和E)（C)细胞表面表达的平均荧光强度(MFI)的IL7-Rαpro-B (B220 + CD19 + IgM−−BP1 CD25−)细胞WT KO年轻和老年老鼠 结论： 活性氧(ROS)在免疫细胞信号转导中起着重要作用，尤其是在B细胞活化和次级淋巴器官的终末分化中。然而，它们在骨髓B细胞发育中的作用仍未得到充分的研究。TP53INP1是肿瘤抑制因子p53的靶点，p53介导其抗氧化活性。该研究报告了一个令人惊讶的观察结果，即tp53inp1缺陷小鼠的慢性氧化应激在衰老过程中促进BM中的B淋巴细胞生成。ROS通过维持活化的STAT5转录因子维持老年tp53inp1缺失BM的IL-7R信号通路，驱动B谱系Pax5转录因子的表达。这项研究表明抗氧化剂不能促进产生抗体的细胞的发育。 英文摘要： Bone marrow (BM) produces allblood and immune cells deriving from hematopoietic stem cells (HSCs). Thedecrease of immune cell production during aging is one of the features ofimmunosenescence. The impact of redox dysregulation in BM aging is still poorlyunderstood. Here we use TP53INP1-deficient (KO) mice endowed with chronicoxidative stress to assess the influence of agingassociated redox alterationsin BM homeostasis. We show that TP53INP1 deletion has no impact onaging-related accumulation of HSCs. In contrast, the aging-related contractionof the lymphoid compartment is mitigated in TP53INP1 KO mice. B cells thataccumulate in old KO BM are differentiating cells that can mature into functionalB cells. Importantly, this phenotype results from B cellintrinsic eventsassociated with defective redox control. Finally, we show that oxidative stressin aged TP53INP1-deficient mice maintains STAT5 expression and activation inearly B cells, driving high Pax5 expression, which provides a molecularmechanism for maintenance of B cell development upon aging. |
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