吉玛基因帮你做双荧光素酶报告基因实验（二）

除了验证miRNA-RNA的靶向关系以外，双荧光素酶报告基因系统可以用来研究另一种基因表达调控机制，即转录因子-启动子区调控机制研究。在这套系统中，荧光素酶报告基因被用来模拟目的基因的转录情况。

目的基因的转录过程除了合成mRNA的RNA聚合酶（RNA polymerase）以外，还需要转录因子（Transcription factor，TF）的参与。众多转录相关的因子共同聚合在一起形成转录复合物才能启动基因转录的过程。

转录复合物的形成必须有转录因子的参与。这是一类具有DNA结合能力的蛋白组成。他们通过DNA binding domain与启动子区的特异性的motif结合，直接参与转录起始调控。其中有的激活，增强靶基因的转录活性（称之为activator），还有一些TF作为repressor反向调控靶基因转录。另外，还有一些蛋白，作为coactivator或者corepressor同样参与转录复合体的形成，以非DNA binding的方式影响靶基因的转录活性。

基于以上原理，双荧光素酶报告基因系统便是非常适用于启动子区转录调控研究的极佳工具。

研究步骤：

1. 首先，我们需要找到靶基因（Targetgene）的启动子区序列。通过NCBI或UCSC数据库可以很容易的得到靶基因的启动子区序列。通常，我们选取-2000~-1共2000bp的序列作为研究对象。

2. 之后，吉玛可以通过全基因合成的方式将该段序列构建于pGL3-basic载体中，得到靶基因的报告基因载体pGL3-Target_WT。如果你想研究目的基因（蛋白）是否对靶基因的转录起调控作用，而目的基因恰好是转录因子，则可以通过生物信息学网站预测该转录因子与靶基因启动子区序列是否结合，结合位点等信息。之后进一步将预测结合位点做突变MUT，与WT相比较做进一步验证。

3. 构建待研究的目的基因（蛋白）的过表达或干扰载体，用于在报告基因系统中实现目的蛋白的差异表达，从而验证出其对靶基因的调控关系。

4. 实验步骤方法详见吉玛基因双荧光素酶报告基因实验指南

预期结果示意图如下

（1）待验证的目的蛋白A不是转录因子。这种情况下该蛋白可能是通过调控转录因子、coactivator或corepressor的活性或表达量来间接地调控靶基因B转录活性的。这种情况下因为目的蛋白A不与靶基因B的启动子区DNA结合，则报告基因载体构建只需要野生型WT来真实反映基因B的转录调控情况。

       EV: Empty Vector;    POI:Protein of Interest  

 （2）待验证的目的蛋白A是转录因子。这种情况下，目的蛋白A是通过与靶基因的启动子区DNA直接结合今儿调控靶基因转录活性的。因而，靶基因启动子区DNA中与目的蛋白结合的motif是至关重要的。吉玛基因通过全基因合成的方式将这个motif序列造成突变（乱序），所构建成的MUT序列将失去与目的蛋白A结合的能力。目的蛋白与启动子区DNA结合位点可通过一些生信预测网站实现，例如：Jaspar.genereg.net；

http://alggen.lsi./cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3；

https://biogrid-lasagna.engr./lasagna_search/index.php

http://gpminer.mbc./等

总结：pGL3-basic双荧光素酶报告基因系统，可以验证目的蛋白与直接靶转录活性间的调控作用。吉玛基因帮你做实验，30-35工作日完成。敬请来电来信咨询。